Computational Design & Analysis of Specific Binding Pockets for Natural and Modified Amino Acids

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Ayyildiz, Merve:
Computational Design & Analysis of Specific Binding Pockets for Natural and Modified Amino Acids.
Bayreuth , 2025 . - VI, 137 S.
( Dissertation, 2025 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Reagent antibodies are widely used in research and diagnostics, yet more than half fail to recognize their targets or exhibit poor specificity, leading to unreliable results. Their production relies on costly and time-consuming immunization processes that are difficult to reproduce. These challenges highlight the urgent need for alternative, well-characterized binding systems that are both reliable and customizable. To address this, the multidisciplinary PRe-ART project aims to replace conventional reagent antibodies with engineered armadillo repeat proteins, which are designed to bind specific amino acid sequences through modular assembly.This thesis contributes to this objective by focusing on the computational design and analysis of binding modules within the designed armadillo repeat protein scaffold, with a particular emphasis on phosphorylated amino acids. Given that phosphorylation of serine, threonine, and tyrosine residues is critical in signaling pathways and metabolism, the lack of high-performing monoclonal antibodies for their detection presents a major challenge. To overcome this, a computational pipeline was established to design binders for phosphotyrosine, phosphoserine, and phosphothreonine. The pipeline prioritized key interactions while minimizing unfavorable mutations, leading to focused binder library suggestions to generate rationally designed libraries. Although experimental validation is ongoing, preliminary results indicate promising binding results. To improve the accuracy of computational predictions, this thesis also evaluates different computational methods that are used for binder library designs, providing insights into their prediction accuracy upon point mutations. By evaluating strengths and weaknesses of these methods, systematic tendencies of them were discovered and a complementary approach that enhances binder design reliability is proposed. Finally, to efficiently validate promising computational predictions, binding affinity measurements for protein-peptide interactions using dArmRPs within our research group were established. Implementing this setup in our lab enabled faster and more practical testing of designed binders, providing a reliable framework for assessing the accuracy of computational predictions. Altogether, this thesis advances the understanding of protein-peptide interactions and demonstrates how this knowledge can be leveraged for the rational design of protein-based binders. By integrating computational strategies with experimental validation, this work contributes to the development of reliable alternatives to traditional reagent antibodies.

Abstract in weiterer Sprache

Reagenzien-Antikörper sind in der Forschung und Diagnostik weit verbreitet, doch mehr als die Hälfte erkennt ihre Ziele nicht oder weist eine geringe Spezifität auf, was zu unzuverlässigen Ergebnissen führt. Ihre Herstellung beruht auf kostspieligen und zeitaufwändigen Immunisierungsverfahren, die sich nur schwer reproduzieren lassen. Diese Herausforderungen unterstreichen den dringenden Bedarf an alternativen, gut charakterisierten Bindungssystemen, die sowohl zuverlässig als auch anpassbar sind. Das multidisziplinäre Projekt PRe-ART zielt darauf ab, herkömmliche Reagenzien-Antikörper durch konstruierte Armadillo-Repeat-Proteine zu ersetzen, die durch modulare Zusammenstellung spezifische Aminosäuresequenzen binden sollen. Die vorliegende Arbeit trägt zu diesem Ziel bei, indem sie sich auf die rechnerische Entwicklung und Analyse von Bindungsmodulen innerhalb des entwickelten Armadillo-Repeat-Proteingerüsts konzentriert, wobei der Schwerpunkt auf phosphorylierten Aminosäuren liegt. Da die Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten für Signalwege und den Stoffwechsel von entscheidender Bedeutung ist, stellt der Mangel an leistungsfähigen monoklonalen Antikörpern für deren Nachweis eine große Herausforderung dar. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine computergestützte Pipeline zur Entwicklung von Bindereagentien für Phosphotyrosin, Phosphoserin und Phosphothreonin entwickelt. Die Pipeline priorisiert die wichtigsten Interaktionen und minimiert gleichzeitig ungünstige Mutationen, was zu gezielten Vorschlägen für Bindungsbibliotheken führt, um rational konzipierte Bibliotheken zu erstellen. Obwohl die experimentelle Validierung noch nicht abgeschlossen ist, deuten die vorläufigen Ergebnisse auf vielversprechende Bindungsergebnisse hin. Um die Genauigkeit der rechnerischen Vorhersagen zu verbessern, werden in dieser Arbeit auch verschiedene rechnerische Methoden bewertet, die für die Entwicklung von Bindungsbibliotheken verwendet werden, und Einblicke in ihre Vorhersagegenauigkeit bei Punktmutationen gegeben. Durch die Bewertung der Stärken und Schwächen dieser Methoden wurden systematische Tendenzen entdeckt, und es wurde ein komplementärer Ansatz vorgeschlagen, der die Zuverlässigkeit der Bindereagenziendesigns erhöht. Um vielversprechende rechnerische Vorhersagen effizient zu validieren, wurden schließlich in unserer Forschungsgruppe Bindungsaffinitätsmessungen für Protein-Peptid-Wechselwirkungen mit dArmRPs durchgeführt. Die Implementierung dieses Aufbaus in unserem Labor ermöglichte eine schnellere und praktischere Prüfung der entworfenen Bindereagenzien und bot einen zuverlässigen Rahmen für die Bewertung der Genauigkeit der rechnerischen Vorhersagen. Insgesamt trägt diese Arbeit zu einem besseren Verständnis von Protein-Peptid-Wechselwirkungen bei und zeigt, wie dieses Wissen für das rationale Design von proteinbasierten Bindereagenzien genutzt werden kann. Durch die Integration von Berechnungsstrategien mit experimenteller Validierung trägt diese Arbeit zur Entwicklung zuverlässiger Alternativen zu herkömmlichen Reagenzien-Antikörpern bei.