From theory to application - 3D bioprinting of cells

Titelangaben

Müller, Sebastian Johannes:
From theory to application - 3D bioprinting of cells.
2023 . - VI, 219 S.
( Dissertation, 2023 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Biofabrication comprises all forms of the automated production of living and functional biological tissue, involving methods from medicine, biology, chemistry, engineering, and physics. The efforts are driven by the growing demand of organ and tissue transplants, the need for improved pharmaceutical drug testing models, prosthetics, and cancer research. The broad spectrum of evolving techniques ranges from advances in cell expansion methods to cell specific bioink development, from assembly and controlled self-assembly of organoids to tissue structures of physiological scale. The most popular manufacturing technology is 3D bioprinting, where established fused-deposition techniques have been translated to operate with bioinks that have special material properties; and hence also special demands. For example, the cytocompatibility and permeability with nutrients, or the micromechanical extra-cellular environment provided by the material, have to be tailored to fit the needs of specific cell types. And while negative biochemical interactions can virtually be eliminated through proper biomaterial choice, the hydrodynamic influences during the fabrication process are what inevitably remains to damage the cells. At which stage of the printing process, and in what magnitude it affects the cells, however, is hardly understood so far. To elucidate the underlying mechanisms, we develop in this thesis a variety of analytical and numerical tools to study the behavior of cells under realistic printing conditions. As a starting point, we investigate the flow of the bioink from the material cartridge through a confined needle and the outlet, which results in elongational and shearing fluid motion acting on the suspended cells. To quantify the major suspect for flow-induced cell damage, the shear stress, we develop a semi-analytical solution of the Navier-Stokes equations for a generalized Newtonian fluid, a class comprising all fluids with strain rate dependent viscosity. A practical Python implementation of our algorithm has become a popular tool among experimentalists of the community. We further propose an analytical method to estimate shear stress induced cell damage during printing, which despite its simplicity accurately reproduces a large experimental data set. The cell is the second essential ingredient in a bioink for printing. We develop a hyperelastic cell model, which we carefully validate with experiments in both an atomic force microscopy based compression setup and several microfluidic devices. We show that the strain hardening effect of the employed Mooney-Rivlin strain energy functional description strongly depends on the mode of deformation which the cell undergoes in either compression or flow. For our flow-based investigations, we modify the theory of Roscoe and demonstrate that its range of applicability can be extended from the description of neo-Hookean particles in a linear shear flow to Mooney-Rivlin particles in a Poiseuille flow and, strikingly, still remains valid for shear thinning suspensions. An essential assumption in both micromechanical characterization techniques as well as in large-scale simulations is the homogeneity of the cell’s interior. We therefore provide systematic proof of the possibility to substitute any elastic inhomogeneity inside the cell with a homogeneous equivalent, and do so for both compression and flow scenarios. Our knowledge gained from the validation of our flow computations and the cell model is then concentrated into the simulation of the three steps of the extrusion process: the nozzle inlet, the nozzle itself, and its exit at the tip. Single cell simulations are performed to elucidate the role of the particular flow patterns and the bioink rheology. Simulations of dense cell suspensions which resemble desired bioprinting conditions supplement this information. We find that the elongational flows at the inlet of the nozzle have an effect similar in magnitude to the maximum shear stresses present in the nozzle. They are almost independent of the trajectory of the entering cell, however, only act on a very short time span. The shear stresses inside the nozzle, on the other hand, act along its entire length, and the duration is inverse proportional to the flow velocity. Hence, cells flowing closer to the wall experience higher stresses for a longer time span, decreasing their potential to survive during extrusion, or maintain proper functionality post-printing. Elongational flows act on the cells a second time when exiting the nozzle at the tip. We find that here their influence is in general lower than the shear stresses inside the nozzle, and the dominating factor is the relaxation from the sheared deformation into the stress-free shape. This thesis is a contribution to research regarding the mechanical behavior of cells in different experimental setups and especially bioprinting-related scenarios. The analytical and numerical methods developed herein are capable of explaining various — but not all — features of the cell behavior and identify the major flow-induced damage factors for cells during extrusion, while offering the potential to be extended with further features.

Abstract in weiterer Sprache

Unter dem Begriff Biofabrikation fasst man alle Formen der automatisierten Herstellung funktionierenden, lebenden, biologischen Gewebes zusammen, wobei Methoden der Disziplinen Medizin, Biologie, Chemie, Ingenieurswesen und Physik Anwendung finden. Getrieben werden diese Entwicklungen durch den stetig steigenden Bedarf an Spendeorganen und -geweben, der Notwendigkeit verbesserter Gewebemodelle für pharmazeutische Studien, Prothetik und die Krebsforschung. Das breite technologische Spektrum reicht dabei von Methoden der Zellexpansion zur Entwicklung maßgeschneiderter Biotinten, von Selbstorganisation und kontrollierter Selbstorganisation von Organoiden zu Gewebestrukturen physiologischer Längenskala. Die dabei prominenteste Technologie ist der 3D Biodruck, wo die bereits etablierte fused deposition-Methode dahingehend erweitert wurde, dass auch Biotinten mit speziellen Materialeigenschaften eingesetzt werden können. Spezielle Anforderungen an die Materialien, etwa die Zellverträglichkeit oder die Permeabilität für Nährstoffe, oder auch die von der Tinte erzeugte mikromechanische Umgebung der Zelle, müssen gemäß der Ansprüche eines jeden Zelltyps angepasst werden. Und selbst wenn die negativen biochemischen Wechselwirkungen durch passende Wahl des Biomaterials im Prinzip ausgeschaltet werden können, bleiben doch unvermeidbar die hydrodynamischen Einflüsse während des Druckprozesses übrig, die die Zellen schädigen können. An welcher Stelle des Druckprozeses und in welcher Stärke diese Einfluss auf die Zellen ausüben, ist bislang nicht vollständig geklärt. Wir beleuchten die zugrundeliegenden Mechanismen in dieser Arbeit mithilfe mehrerer analytischer und numerischer Werkzeuge, mit denen wir das Verhalten von Zellen unter realistischen Druckbedingungen untersuchen. Als Einstiegspunkt betrachten wir die Strömung der Biotinte von der Materialkartusche beginnend durch die Nadel und die Öffnung am Ende, wobei sowohl Elongations- als auch Scherströmungen auftreten, die auf die suspendierten Zellen wirken. Scherspannungen gelten dabei weitgehend als Hauptursache für Zellschäden. Wir berechnen diese über eine semi-analytische Lösung der Navier-Stokes Gleichungen für generalisierte Newtonsche Fluide, eine Klasse, die jegliche Fluide beschreibt, deren Viskosität von der lokalen Dehnrate abhängt. Unsere anwenderfreundliche Python Implementierung dieses Algorithmus hat sich zu einem beliebten Werkzeug der Experimentalisten entwickelt. Mit einer weitaus simpleren analytischen Methode können wir die von rein durch Scherspannungen verursachte Zellschädigung bereits hervorragend abschätzen, wie wir durch Reproduktion eines großen experimentellen Datensatzes zeigen. Zellen sind die zweite essentielle Zutat einer Biotinte für den 3D Druck. Wir entwickeln ein hyperelastisches Zellmodell, welches wir mit Experimenten sowohl aus Rasterkraftmikroskopie als auch Mikrofluidischen Messungen validieren. Dabei zeigen wir, dass die Stärke der Dehnverhärtung der verwendeten Beschreibung durch ein Mooney-Rivlin Dehnenergiefunktional insbesondere von der Deformationsmode abhängt, die die Zelle unter Kompression oder in Fluss annimmt. Zur Betrachtung einer Zelle in der Strömung erweitern wir die Theorie von Roscoe und demonstrieren, dass ihr ursprünglicher Anwendungsbereich deutlich erweitert werden kann: von einem Partikel mit neo-Hookscher Elastizität in einer linearen Newtonschen Strömung hin zu einem Mooney-Rivlin Partikel in einer parabolischen Poiseuille-Strömung und tatsächlich auch für Zellsuspensionen in scherverdünnenden Fluiden in einer nichtlinearen Rohrströmung. In mechanischen Charakterisierungsmethoden von Zellen wie auch in großen Simulationen ist eine häufige Annahme die elastische Homogeneität des Zellinneren. Wir zeigen daher systematische Belege dafür, wie eine Zelle mit beliebig elastisch heterogenem inneren Aufbau grundsätzlich durch eine gleichwertige, homogene Zelle ersetzt werden kann. Diese Betrachtungen führen wir in Kompressions- und in Strömungsszenarien durch. Die Erkenntnisse aus der Validierung des Zellmodells und der Flussberechnungen konzentrieren wir abschließend in unseren Simulationen der wichtigsten Stufen des 3D Biodruckprozesses: (i) dem Eintritt in die Nadel, (ii) der Nadel selbst und (iii) dem Austritt an der Spitze. Simulationen mit einzelnen Zellen klären dabei die Rolle der unterschiedlichen Strömungsmuster und der Rheologie der Biotinte. Unterstützt und erweitert werden diese mit Simulationen von dichten Zellsuspensionen, die realen Biodruck-Bedingungen entsprechen. Es zeigt sich, dass die Elongationsflüsse am Nadeleintritt einen Einfluss auf die Zellen haben, der vergleichbar ist mit dem der maximalen Scherspannungen innerhalb der Nadel. Der Einfluss ist außerdem annähernd unabhängig von der Trajektorie der Zelle. Er wirkt jedoch nur auf einer kurzen Zeit- und Längenskala, wohingegen die Scherspannungen innerhalb der Nadel auf der gesamten Länge wirken, wobei die Zeitskala invers proportional zur Flussgeschwindigkeit ist. Daher erfahren Zellen, die nahe der Nadelwand fließen, höhere Spannungen und diese zugleich für längere Zeit, was ihr Überlebenspotential nach dem Druck einschränkt. Beim Nadelaustritt wirken ein zweites Mal Elongationsflüsse auf die Zelle ein, hier allerdings im allgemeinen schwächer als am Eintritt. Der dominante Prozess ist die Relaxation vom gescherten in den kräftefreien Zustand. Diese Arbeit bildet einen Beitrag zur Forschung über Zell- und Strömungsmechanik in verschiedenen experimentellen Aufbauten und im Speziellen für relevante Szenarien des 3D Biodrucks. Die entwickelten analytischen wie auch numerischen Methoden können einige — wenn auch nicht alle — Eigenschaften des Zellverhaltens erklären und die dominierenden Einflüsse strömungsbedinger Zellschädigung während eines Extrusionsprozesses identifizieren. Sie können in Zukunft leicht mit zusätzlichen Funktionen erweitert werden.