Characterization and engineering of ligand binding in the periplasmic binding protein PotF

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Kröger, Pascal:
Characterization and engineering of ligand binding in the periplasmic binding protein PotF.
Bayreuth , 2025 . - IX, 115 S.
( Dissertation, 2023 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Periplasmic binding proteins (PBPs) are a highly versatile superfamily of proteins that cover a diverse spectrum of ligands in bacteria and archaea. They display a “Venus-flytrap” architecture which consists of two β/α-lobes connected by a hinge region with the ligand binding site located at the interface of the two lobes. PBPs are predominantly open in solution and undergo a large conformational change (closure) upon ligand binding. PotF is E. coli’s putrescine (PUT) PBP and recruits its ligand to the PotFGHI ABC-transporter system to facilitate uptake. In this thesis apo PotF as well as its binding mechanism and capabilities for other metabolically relevant biogenic amines has been investigated thermodynamically, in silico, and structurally. Results showed how PotF promiscuously binds agmatine (AGM), cadaverine (CDV), spermidine (SPD) and spermine (SPM) in a nanomolar to high micromolar range. SPD and AGM raised particular interest for further investigations. SPD uptake in E. coli is facilitated by PotD, a homolog of PotF that in its binding pocket displays seven differences. Prior to this work a PotF variant carrying these seven mutations was generated (PotF/D) and demonstrated a switch in polyamine preference from PUT to SPD. Unfortunately, PotF/D did not display nanomolar affinity for SPD, but simply conserved the already established mediocre binding from PotF wild type in PotF/D. Additionally, the crystal structure of PotF/D displayed a slightly more open conformation after binding SPD. This was only once previously observed for PotF binding with the large ligand SPM, which seems to interfere with complete closure. In this work the sequence space for the seven residue differences was combinatorically analyzed in terms of polyamine preference for SPD and PUT in several PotF constructs. Furthermore, specific residues that were deemed important for closure before, and their surrounding were targeted by mutagenesis to enable a full conformational change in PotF/D as complete closure can improve ligand binding. Through systematic analysis of all the different variants, effects on PUT and SPD polyamine preference in PotF can be pinpointed to specific binding pocket residues. Moreover, it was possible to improve the SPD affinity of PotF/D and to generate a version of PotF, which has its original polyamine specificity (nanomolar for PUT and micromolar for SPD) reversed. This can have implications for medical research as SPD uptake is linked to pathogenesis in multidrug resistant gram-negative bacteria and has been targeted by treatment strategies. Having highly adaptable PBPs like PotF at their disposal might allow pathogens to use the PotFGHI system to enable SPD uptake and bypass treatment strategies. The ligand AGM on the other hand is a neuromodulator and shows an influence on multiple neurotransmitter systems. Additionally, it is assumed to be a non-selective drug with multiple targets. AGMs specific modes of action and mechanisms are largely unknown and unexplored; therefore, this thesis presents the development of an AGM biosensor by inserting a circularly permuted GFP (cpGFP) into PotF. The gained insight from the PotF wildtype and the PotF/D study were combined to semi-rationally engineer an AGM specific PotF receptor module as well as a non-binding control variant, which combined with cpGFP resulted in the AGM sensor AGMsen and a control sensor. The non-binding control sensor offers a control when setting up experiments. AGMsen allows fluorescence tracking of AGM in a non-invasive manner upon ligand binding inside and displayed on HEK cells, as well as displayed on rat hippocampal neurons. This proves functionality of the PotF-based sensor which paves the way for further engineering and is a first step towards improving the understanding of AGMs function in the brain.

Abstract in weiterer Sprache

Die periplasmatischen Bindeproteine (PBPs) sind eine vielfältige Superfamilie von Proteinen, die ein breites Spektrum an Liganden in Bakterien und Archaeen binden. Sie bestehen aus zwei β/α-Domänen, die durch eine Scharnierregion verbunden sind. Diese Konstellation wird auch als "Venus-Fliegenfallen"-Architektur bezeichnet, wobei sich die Ligandenbindungsstelle zwischen den Grenzflächen der beiden Domänen befindet. In Lösung liegen PBPs vorwiegend in einem offenen Zustand vor und vollziehen bei Ligandenbindung eine große Konformationsänderung (Schließung). PotF ist E. colis Putrescin (PUT) PBP und rekrutiert seinen Liganden an das PotFGHI ABC-Transportersystem, um so die Aufnahme von PUT ins Zellinnere zu ermöglichen. In der hier vorgelegten Promotionsarbeit wurden apo PotF und sein Bindungsmechanismus für andere metabolisch relevante biogene Amine thermodynamisch, in silico und strukturell untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass PotF neben PUT auch Agmatin (AGM), Cadaverin (CDV), Spermidin (SPD) und Spermin (SPM) mit nanomolaren bis hoch mikromolare Affinitäten bindet. SPD und AGM sind hierbei von besonderem Interesse für weitere Untersuchungen. Die Aufnahme von SPD erfolgt in E. coli durch PotD, ein homologes Protein zu PotF, welches in seiner Bindungstasche sieben Unterschiede aufweist. Vor dieser Arbeit wurde eine PotF-Variante mit diesen sieben Mutationen erzeugt (PotF/D), die eine Veränderung der Polyaminpräferenz von PUT zu SPD zeigte. Leider weist PotF/D keine nanomolare Affinität für SPD auf, sondern konserviert lediglich die bereits vorhandene SPD-Affinität vom PotF-Wildtyp. Des Weiteren zeigt die Kristallstruktur von PotF/D nach Bindung von SPD eine halbgeschlossene Konformation, die zuvor nur einmal bei der Bindung von PotF mit SPM beobachtet wurde, einem Liganden, der auf Grund seiner Größe die vollständige Schließung zu stören scheint. In dieser Arbeit wurde der Sequenzraum für die sieben Positionsunterschiede in Bezug auf die Polyaminpräferenz für SPD und PUT in mehreren PotF-Konstrukten kombinatorisch analysiert. Darüber hinaus wurden spezifische Reste, die zuvor als wichtig für die Schließung identifiziert wurden, sowie ihre Umgebung durch Mutagenese gezielt verändert, um eine vollständige Schließung in PotF/D zu ermöglichen und so die Ligandenaffinität zu verbessern. Durch eine systematische Analyse der verschiedenen Varianten konnten die Auswirkungen auf die PUT- und SPD-Polyaminpräferenz in PotF auf spezifische Reste in der Bindetasche zurückgeführt werden. Darüber hinaus war es möglich, die Affinität von PotF/D zu SPD zu verbessern und eine Variante von PotF zu erzeugen, bei der die ursprüngliche Polyaminpräferenz (nanomolar für PUT und mikromolar für SPD) umgekehrt ist. Dies sind interessante Aspekte für die medizinische Forschung, da die SPD-Aufnahme mit der Pathogenese multiresistenter gramnegativer Bakterien in Verbindung gebracht wird und Gegenstand von Behandlungsstrategien gegen diese ist. Pathogene, die über hochgradig anpassungsfähige PBPs wie PotF verfügen, könnten das PotFGHI-System nutzen, um SPD-Aufnahme zu ermöglichen und so Behandlungsstrategien umgehen. Im Gegensatz zu SPD ist AGM ein Neuromodulator und beeinflusst verschiedene Neurotransmittersysteme. Zudem wird angenommen, dass AGM ein nicht-selektiver Wirkstoff mit mehreren molekularen Zielen ist, der Behandlungsstrategien unterstützen kann. AGMs spezifische Wirkungsweise und Mechanismen sind weitgehend unbekannt und unerforscht. Daher geht es in dieser Promotionsarbeit auch um die Entwicklung eines AGM-Biosensors der durch Einbringung eines zirkulär permutierten GFP (cpGFP) in PotF konstruiert wurde. Die gewonnenen Erkenntnisse aus der PotF-Wildtyp und der PotF/D-Studie wurden kombiniert, um ein AGM-spezifisches PotF-Rezeptormodul sowie eine nicht-bindende Kontrollvariante zu entwickeln. Die Kombination dieser mit cpGFP resultierten im AGM Sensor AGMsen und einem Kontrollsensor. Der Kontrollsensor kann in Experimenten als Negativkontrolle fungieren und AGMsen ermöglicht die nicht-invasive Fluoreszenzverfolgung von AGM nach Ligandenbindung in und auf HEK-Zellen sowie auf hippocampalen Neuronen der Ratte. Dies bestätigt die Funktionalität des PotF-basierten Sensors, der somit einen ersten Schritt zum besseren Verständnis der Funktion von AGM im neuronalen System darstellt.