Synthesis of glutathione analogues to investigate the enzymatic mechanism of phytochelatin synthase by fluorescence spectroscopy

Titelangaben

Kempf, Oxana:
Synthesis of glutathione analogues to investigate the enzymatic mechanism of phytochelatin synthase by fluorescence spectroscopy.
Bayreuth , 2025 . - 69 S.
( Dissertation, 2022 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Phytochelatin synthase (PCS) is an enzyme ubiquitous in the plant kingdom and present in numerous species of fungi and animals but not in vertebrates. It can act both as a peptidase, by cleaving off the glycine from glutathione (GSH), and as transpeptidase, by transferring the remaining γ-glutamyl-cysteine (γEC) dipeptide onto another GSH molecule. This reaction forms the so-called phytochelatins (PCs) which play an important role in heavy metal detoxification and metal homeostasis. In addition to synthesis of PCs, PCS has also been discussed to be involved in other processes such as xenobiotic catabolism. The enzymatic mechanism has not yet been characterized in detail. Prokaryotic PCS-like enzymes show homology to the catalytic N-terminal domain of eukaryotic PCS and display mainly peptidase activity. However, mechanistic understanding is lacking and their natural functions are even less evident. The substrate of PCS is GSH, which is ubiquitous in almost all living organisms and it is the most abundant non-protein thiol in mammalian cells. Its main functions are redox activity including the constitution of the cytosolic redox buffer and redox signalling, being nucleophile for the detoxification of electrophilic toxins and cofactor for the biosynthesis of eicosanoids, steroids and iron-sulphur clusters. In the present work, we set out to study in detail the enzymatic mechanism of the PCS-like enzyme from the cyanobacterium Nostoc (NsPCS) using spectroscopic methods, such as NMR, absorbance and fluorescence. Since appropriately labelled GSH derivatives as substrate analogues were not commercially available, we developed an efficient modular reaction system based on a protection group pattern that allows us to produce various derivatives of GSH. The synthesis starts from three natural amino acids each of which featuring three functional groups. The protected building blocks can be synthesized and coupled in large laboratory scale with good to excellent yields. In order to study the peptidase reaction of PCS, we synthesized a double chromophore-labelled derivative (i.e., a fluorogenic GSH probe) containing a donor-acceptor pair suitable for FRET-based fluorescence experiments. As donor, we used the commercially available bimane, which can be easily linked to the cysteine- thiol. Since the widely used quencher dabcyl is very poorly soluble in water, which is the natural medium for biological systems, we developed the hydroxylated derivative hydrodabcyl. In detailed characterization studies, we showed its superiority over the parent compound with respect to water solubility and absorption properties. As an application of the double chromophore-labelled GSH derivative, we carried out different experiments for monitoring the peptidase activity of NsPCS by increase of fluorescence. When studying enzyme kinetics, non-cleavable substrate analogues are important to distinguish between catalysis and binding. In addition, such derivatives often act as inhibitors which can be also of pharmacological importance. We addressed this aspect by additionally preparing derivatives containing three different non-cleavable peptide bond isosters of the bond between cysteine and glycine, namely the N-methylated amide, the reduced CH2 amino group and a ketone. For structural characterization of NsPCS, we presented three crystal structures. Two structures were obtained from the wild-type enzyme crystallized in presence and absence of its substrate GSH. Unexpectedly, the structure obtained with GSH showed the acyl-enzyme intermediate, i.e., the γEC dipeptide bound as thioester to the active site cysteine. The novel discovery was the presence of a second GSH molecule in this complex, bound via disulphide to the γEC dipeptide. A third structure was obtained from the catalytically inactive cysteine-to-serine mutant, which was found to co-crystallize in complex with GSH without addition of GSH to the crystallization buffer. Kinetics studies measured by NMR and fluorescence confirmed on the one hand the catalytic cleavage of reduced GSH. In presence of oxidized GSSG on the other hand, stoichiometric conversion of the enzyme into the acyl-enzyme intermediate occurred leaving the complex unable for further transformations. This result infers the biological significance of PCS as a redox sensor and also implies the evolutionary emergence of phytochelatins having potentially formed at first spontaneously by an intramolecular S-N- acyl shift on the blocked acyl-enzyme intermediate. In summary, we provide novel aspects concerning the enzymatic mechanism and function of NsPCS obtained by crystallography and NMR spectroscopy. For kinetic studies on NsPCS with fluorescence spectroscopy, we synthesized a fluorogenic probe based on its substrate GSH. The practical modular synthesis of GSH-analogues that we have developed is extremely helpful in the investigation of PCS and is expected to boost studies of many other GSH-dependent enzymes. As a part of the fluorogenic probe, we synthesized a novel water-soluble universal dark quencher hydrodabcyl, which was even patented due to its general utility.

Abstract in weiterer Sprache

Phytochelatin Synthase (PCS) ist ein Enzym, welches in vielen Arten aus den Reichen der Pflanzen, Pilze und Tiere vorkommt. PCS kann sowohl Glycin von Glutathion (GSH) abspalten (Peptidase-Aktivität), als auch das resultierende γ-Glutamyl-Cystein Dipeptid (γEC) auf ein anderes GSH- Molekül übertragen (Transpeptidase-Aktivität). Diese Reaktion bildet die sogenannten Phytochelatine, welche eine wichtige Rolle für Schwermetallentgiftung und Metallhomöostase spielen. Zusätzlich zur Synthese von Phytochelatinen hat PCS auch noch weitere Funktionen wie der Abbau von Glutathion S-Konjugaten. Der katalytische Mechanismus ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Prokaryotische PCS-like-Proteine besitzen eine Sequenzhomologie zu der N-terminalen katalytischen Domäne von eukaryotischen PCS. Sie zeigen hauptsächlich Peptidase-Aktivität aber ihre biologische Funktion ist noch weniger eindeutig. Das Substrat von PCS ist GSH, welches ubiquitär in fast allen lebenden Organismen vorkommt und der häufigste nicht-Protein-Thiol in Säugetieren ist. Seine Hauptfunktionen sind Redoxaktivität inklusive der Rolle als cytosolischer Redox-Puffer und Redox-Signalisation; der Thiol ist Nucleophil für die Entgiftung von elektrophilen Toxinen und GSH agiert als Kofaktor in der Biosynthese von Eicosanoiden, Steroiden und Eisen-Schwefel-Komplexen. Für die vorliegenden Studien haben wir den enzymatischen Mechanismus des PCS-like- Enzyms aus dem Cyanobacterium Nostoc (NsPCS) mithilfe spektroskopischer Methoden wie Absorption, Fluoreszenz und NMR untersucht. Weil passende Chromophor-markierte GSH- Derivate als Substratanaloga nicht kommerziell erhältlich waren, haben wir ein modulares System entwickelt, um verschiedene GSH-Derivate zu synthetisieren. Dabei gingen wir aus von drei Aminosäure-Hauptbausteinen, die jeweils drei funktionelle Gruppen enthalten. Die geschützten Bausteine können in großem Labor- Maßstab und in guten bis hervorragenden Ausbeuten synthetisiert, selektiv entschützt und gekoppelt werden. Um die Peptidase-Reaktion von PCS zu untersuchen, haben wir ein doppelt Chromophor- markiertes fluorogenes GSH-Derivat synthetisiert, welches ein Donor-Akzeptor-Paar für FRET-basierte Fluoreszenzmessungen enthält. Als Donor haben wir das kommerziell erhältliche Biman verwendet, welches leicht mit dem Thiol des Cysteins gekoppelt werden kann. Da der kommerziell erhältliche und häufig als Fluoreszenzlöscher eigesetzte Azofarbstoff Dabcyl sehr schlecht in Wasser löslich ist, haben wir mit Hydrodabcyl ein hydroxyliertes Derivat entwickelt. In detaillierten Charakterisierungsstudien haben wir dessen Vorteile gegenüber dem Mutterchromophor Dabcyl im Hinblick auf Wasserlöslichkeit und Absorptionsverhalten aufgezeigt. Wir beschrieben in verschiedenen Experimenten die Anwendung des fluorogenen GSH-Derivates für die Quantifizierung der Peptidase-Aktivität von PCS durch Zunahme der Fluoreszenz. Für die Untersuchung von Enzymkinetik sind nicht spaltbare Substratanaloga wichtig, um Bindung von Katalyse einzeln zu analysieren. Solche Analoga wirken zusätzlich oft als Inhibitor und können dadurch auch pharmakologische Bedeutung erlangen. Wir haben diesen Aspekt in unsere Synthesen eingebracht durch die Herstellung von Derivaten, die anstatt der Bindung zwischen Cys und Gly drei unterschiedliche nicht-spaltbare Peptidbindungsisostere enthalten, nämlich das N-methylierte Amid, die reduzierte CH2-Aminogruppe und das Keton. In einer weiteren Publikation werden drei Kristallstrukturen von NsPCS präsentiert. Das Wildtypenzym wurde kristallisiert mit und ohne sein Substrat GSH. Unerwarteter Weise zeigte die Struktur, die mit GSH erhalten wurde, das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt, d.h. das γEC-Dipeptid bildet einen Thioester mit dem katalytisch aktiven Cys. Die neue Entdeckung war aber die Präsenz eines zweiten GSH-Moleküls im selben Komplex, welches über eine Disulfidbrücke am γEC-Dipeptid gebunden war. Die dritte Kristallstruktur wurde von einer katalytisch inaktiven Cys-zu-Ser-Mutante von NsPCS erhalten, die interessanterweise mit GSH ko-kristallisierte, ohne Zugabe von GSH zum Kristallisationspuffer. Kinetikmessungen mittels NMR und Fluoreszenz bestätigten die katalytische Spaltung von reduziertem GSH. In Gegenwart von oxidiertem GSSG jedoch, erfolgte die quantitative Umsetzung des Enzyms zu einem stabilen Acyl-Enzym-Zwischenprodukt, welches nicht weiter reagierte. Dieses Ergebnis legte die biologische Bedeutung von PCS als Redox-Sensor nahe und lieferte auch einen Hinweis auf die evolutionäre Entstehung von Phytochelatinen, die sich erstmals spontan durch eine intramolekulare S-N-Acylverschiebung am blockierten Acyl-Enzym-Zwischenprodukt gebildet haben könnten. Zusammenfassend werden neue Aspekte betreffend des enzymatischen Mechanismus und der Funktion von NsPCS vorgestellt, die mittels Protein-Kristallstruktur und NMR-Spektroskopie erhalten wurden. Um Kinetikstudien von NsPCS mittels Fluoreszenzspektroskopie zu ermöglichen, wurde eine fluorogene Sonde auf Basis des Substrates GSH synthetisiert. Die modulare Synthese von GSH-Analoga, die wir entwickelt haben, ist sehr hilfreich für Untersuchungen an PCS und kann auch die Studien an vielen anderen GSH-abhängigen Enzymen vorantreiben. Als Teil dieser fluorogenen Sonde haben wir einen neuen wasserlöslichen universellen Fluoreszenzlöscher synthetisiert, welcher aufgrund seiner allgemeinen Nützlichkeit sogar patentiert wurde.