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Activation and inhibition of Sirt6 by small molecules

DOI zum Zitieren der Version auf EPub Bayreuth: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00004450
URN zum Zitieren der Version auf EPub Bayreuth: urn:nbn:de:bvb:703-epub-4450-1

Titelangaben

You, Weijie:
Activation and inhibition of Sirt6 by small molecules.
Bayreuth , 2019 . - 120 S.
( Dissertation, 2019 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

Abstract

Mammals have 7 Sirtuin isoforms (SIRT1–7) localized in different subcellular compartments and with different functions. Sirt6 is a heterochromatin-associated protein that serves in the regulation of telomere maintenance, DNA repair and gene expression. A Sirt6 knockout causes aging-associated degeneration in mice. Conversely, Sirt6 overexpression has been reported to extend lifespan in male mice. Thus, activators of Sirt6 are considered to be attractive therapeutics to treat cancer and age-related diseases. Sirtuin-activating compounds (STACs) were initially described to activate Sirt1, and bind to the Sirt1’s unique N-terminal segment (SBD domain). In contrast, progress towards the development of activators which modulate the activity of other Sirtuin isoforms that lack the Sirt1’s SBD domain has been significantly taken up speed only recently. The pyrrolo[1,2-a]quinoxaline-derived compound UBCS038 were previously characterized as a very weak Sirt6 activator. We screened a panel of pyrrolo[1,2-a]quinoxaline-derived derivatives and identified several compounds as more potent activators for Sirt6-dependent deacetylation of peptide substrates, histone proteins and complete nucleosomes. Furthermore, these compounds showed no effect on Sirt1, 2 and 3, but promoted the desuccinylase activity of Sirt5. Solving the complex structures by using X ray crystallography revealed that these compounds as the first synthetic Sirt6 activators bind to the Sirt6 specific acyl channel branching from the catalytic core and activate Sirt6 deacetylation by an allosteric mechanism, which can explain their different effects against acyl substrates. Moreover, structure-activity relationship analyses indicate that the presence of a nitrogen atom in the meta position of the pyridine group is crucial for ligand affinity or Sirt6 activation. Our data reveal promising acyl-selective Sirt6 activators and offer clues for the development of Sirt6 drug-like compounds as molecular tools and potential therapeutics. Next, we utilized a robust mass spectrometry-based assay to determine the effect of quercetin on Sirtuins. We confirmed the weak activation effect of quercetin for Sirt6 and found out that quercetin can inhibit other Sirtuin isoforms. We solved crystal structures of a Sirt6/quercetin complex and a Sirt2/quercetin complex to reveal two mutually exclusive binding modes that lead to the dual effects of quercetion among Sirtuins. Based on the structural information, we have identified a novel quercetin derivative, namely isoquercetin, able to activate Sirt6 with improved selectivity. We then determined the crystal structure of Sirt6 and isoquercetin to better understand its activation mechanism. Moreover, we also confirmed the effects of quercetin derivatives catechin gallate (the first potent Sirt6 inhibitor) and cyaniding (the most robust Sirt6 activator) in our mass spectrometry assay and further determined the crystal structures of Sirt6 in complex with these two compounds. Our results demonstrate that the substitution in the C ring of quercetin can significantly alter the effect of compounds from activation to inhibition, and reveal molecular features essential for further drug development. Trichostatin A (TSA) inhibits classical HDACs by chelating the zinc ion in the active site, but in Sirtuins the zinc ion does not play a catalytic role and its binding site is remote from the catalytic site. Surprisingly, TSA is also identified to show promising efficacy towards Sirt6, while demonstrates no appreciable inhibitory effect on Sirt1-3 or Sirt5.We obtained the Sirt6/TSA complex structure by soaking experiment. We found that TSA binds into the C pocket of the NAD+ binding site and inserts into Sirt6's specific acyl binding channel, which thus explains its relative specificity for Sirtuin isoforms. Binding studies further revealed that TSA binds to Sirt6 in a noncompetitive manner with respect to ADP-ribose (fragment of NAD+) or substrate, suggesting that TSA might acts as sirtuin inhibitor via binding to the C pocket upon the dissociation of NAM group and prevent product release by stabilizing the intermediate complex. Our data provides insight into the TSA binding site and the inhibition mechanism to support the development of Sirt6-selective inhibitors.

Abstract in weiterer Sprache

In Säugetieren existieren 7 Sirtuin Isoformen (SIRT1-7), die in verschiedenen Zellkompartimenten lokalisiert sind und verschiedene Funktionen ausüben. Sirt6 ist ein mit Heterochromatin assoziiertes Protein, welches in der Regulation der Erhaltung von Telomer-Strukturen, DNA-Reparatur, und Genexpression involviert ist. Ein Sirt6 Knockout in Mäusen führt zu beschleunigtem, altersbedingtem Verfall. Im Gegensatz dazu führt die Überexpression von Sirt6 zur Verlängerung der Lebensspanne männlicher Mäuse. Daher werden Sirt6-Aktivatoren als attraktive potentielle Therapeutika für Krebs und alterungsbedingte Krankheiten angesehen. Synthetische Sirtuin-Aktivatoren (Sirtuin-activating compounds, STACs) wurden ursprünglich für Sirt1 beschrieben und binden an eine Sirt1-spezifische Domäne N-terminal von der katalytischen Domäne (SBD, für STAC-binding domain). Die Entwicklung von Aktivatoren anderer Sirtuin-Isoformen, welche die einzigartige Sirt1 SBD nicht besitzen, hat sich erst kürzlich beschleunigt. Die von Pyrrolo[1,2-a]Chinoxalin abgeleitete Substanz UBCS038 ist als schwacher Sirt6-Aktivator beschrieben worden. Im Zuge dieser Arbeit wurden verschiedene Pyrrolo[1,2-a]Chinoxalin Derivate synthetisiert und es konnten verschiedene Substanzen, welche die Deacetylierungsaktivität von Sirt6 gegenüber Peptid-Substraten, Histonproteinen und Nucleosomen stimulieren, identifiziert werden. Darüber hinaus zeigten diese Substanzen keinen Effekt auf Sirt1, 2, und 3, förderten jedoch die Desuccinylase-Aktivität von Sirt5. Strukturelle Studien zeigten, dass diese Substanzen – die ersten charakterisierten Sirt6-Aktivatoren – in dem Sirt6-spezifischen Acylkanal binden, der vom katalytischen Zentrum ausgeht und die Sirt6 Deacetylierung durch einen allosterischen Mechanismus aktiviert. Dies erklärt auch die verschiedenen Effekte auf Acylsubstrate. Weiterhin zeigen die Analysen der Struktur-Wirkungsbeziehung, dass die Präsenz eines Stickstoffatoms in meta-Stellung zum Pyridin-Rest essentiell für die hochaffine Bindung sowie Sirt6 Aktivierung ist. Unsere Daten weisen auf vielversprechende acylselektive Sirt6 Aktivatoren hin und liefern Hinweise zur Entwicklung von Wirkstoffkandidaten, die als molekulare Werkzeuge und potentielle Therapeutika dienen können. Des Weiteren verwendeten wir einen auf massenspektrometrischer Analyse beruhender Assay, um die Wirkung von Quercetin auf Sirtuine zu untersuchen. Wir konnten bestätigen, dass Quercetin Sirt6-aktiviert, aber andere Sirtuinisoformen inhibiert. Unsere Kristallstrukturen von Sirt6 und Sirt2 im Komplex mit Quercetin zeigen, dass die Substanz in zwei nicht miteinander zu vereinbarenden Bindungsmodi an Sirt6 bzw. Sirt2 bindet und diese die unterschiedlichen Wirkungen von Quercetin auf verschiedene Sirtuinisoformen bedingen. Auf Basis dieser Kristallstrukturen haben wir ein Quercetin-Derivat, nämlich Isoquercetin, definiert, welches eine erhöhte Selektivität gegenüber Sirt6 zeigt. Um den Mechanismus, der zur Aktivierung führt, zu verstehen, haben wir die Kristallstruktur des Sirt6/Isoquercetin-Komplexes gelöst. Außerdem bestätigten wir die Effekte der Quercetinderivate Catechin-Gallat (der erste potenter Inhibitor) und Cyanidin (der stärkste Sirt6-Aktivator) auf Sirt6 mit unserem Massenspektrometrieassay und lösten die Kristallstrukturen von Sirt6 in Komplex mit diesen Verbindungen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Austausch im C-Ring von Quercetin signifikant den Effekt der Substanz von Aktivierung zu Hemmung hin verändern kann und schaffen die molekulare Grundlage für die weitere Medikamentenentwicklung. Trichostatin A (TSA) inhibiert klassische HDACs, indem es das Zink-Ion im katalytischen Zentrum komplexieren. In Sirtuinen hingegen spielt das Zink-Ion keine katalytische Rolle und die Zinkbindestelle befindet sich nicht in der Nähe des katalytischen Zentrums. Überraschenderweise zeigt TSA dennoch eine vielversprechende Wirkung auf Sirt6, aber besitzt für Sirt1-3 bzw. Sirt5 keinen inhibitorischen Effekt. Wir konnten die Komplexstruktur von Sirt6 mit TSA lösen und fanden heraus, dass TSA in der C-Tasche der NAD+-Bindestelle bindet und sich in den Sirt6 spezifischen Kanal einfügt. Dies erklärt die Isoformspezifität. Bindungsexperimente ergaben ferner, dass TSA in einer nichtkompetitiven Weise zu ADP-ribose (Fragment von NAD+) oder einem Substrat an Sirt6 bindet. Dies legt nahe, dass die inhibitorische Wirkung von TSA durch Bindung in der C-Tasche nach Dissoziation der NAM-Gruppe erfolgt und durch die Stabilisierung des Intermediatkomplexes die Freisetzung des Produktes verhindert wird. Unsere Daten beleuchten die molekulare Struktur der TSA-Bindetasche und den Inhibitionsmechanismus. Beides trägt zur Entwicklung Sirt6 spezifischer Inhibitoren bei.

Weitere Angaben

Publikationsform: Dissertation (Ohne Angabe)
Keywords: Sirtuin activators; Sirtuin inhibitors; protein structures; enzyme complex
Fachklassifikationen: 92C40
Themengebiete aus DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften; Biologie
Institutionen der Universität: Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie > Lehrstuhl Biochemie
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie > Lehrstuhl Biochemie > Lehrstuhl Biochemie I - Proteinbiochemie der Signaltransduktion - Univ.-Prof. Dr. Clemens Steegborn
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie > Lehrstuhl Biochemie > Lehrstuhl Biochemie III - Proteindesign - Univ.-Prof. Dr. Birte Höcker
Graduierteneinrichtungen > University of Bayreuth Graduate School
Fakultäten
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie
Graduierteneinrichtungen
Sprache: Englisch
Titel an der UBT entstanden: Ja
URN: urn:nbn:de:bvb:703-epub-4450-1
Eingestellt am: 18 Jan 2021 07:31
Letzte Änderung: 18 Jan 2021 07:31
URI: https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/4450

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