Regulation of Mitochondrial Sirtuins Sirt3 and Sirt5 by Small Molecules

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Nguyen, Giang Thi Tuyet:
Regulation of Mitochondrial Sirtuins Sirt3 and Sirt5 by Small Molecules.
Bayreuth , 2014 . - IX, 92 S.
( Dissertation, 2014 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Sirtuins are a highly conserved family of protein deacylases that are important regulators of metabolism, longevity and aged-related diseases. There are seven sirtuin isoforms in mammals with different subcellular localization, substrates and biological functions. Three sirtuin isoforms, Sirt3-5, are located in the mitochondria and play significant roles in all mitochondrial processes. This study investigates the modulations of small molecule compounds on mitochondrial sirtuins Sirt3 and Sirt5 using structural characterization as well as biochemical and biophysical analysis. Resveratrol, a polyphenol found in red wine, was reported to activate Sirt1. Testing resveratrol and its related compounds including piceatannol, polydatin, 4’-bromo-resveratrol against Sirt3 showed an inhibitory effect. Among these compounds, brRESV is the most potent Sirt3 inhibitor. Crystal structures of Sirt3 in complex with FdL-1 peptide and piceatannol/polydatin showed a direct interaction between the compounds and the peptide coumarin ring to induce non-productive substrate binding, thus inhibit the enzyme activity. Crystal structures of the complex Sirt3/FdL-1/4’-bromo-resveratrol and Sirt3/ACS2/4’-bromo-resveratrol revealed two different compound binding sites. Biochemical and binding data indicated that the binding site of 4’-bromo-resveratrol in the FdL-1 complex involved in inhibition mechanism whereas the compound binding site in the ACS2 complex might imply the site for the activation mechanism of resveratrol on Sirt1. Resveratrol unrelated compounds including SRT1720, a potent synthetic Sirt1 activator, and Ex-527, a potent Sirt1 inhibitor, also inhibited Sirt3. In the crystal structure of the complex Sirt3/carba-NAD+/SRT1720, the compound showed competition with substrate peptide by occupying the binding region of acetyl lysine. SRT1720 interacts with NAD+ and the binding analysis indicated that the NAM moiety of NAD+ is essential for SRT1720 binding. The crystal structure of Sirt3 in the presence of NAD+ and SRT1720 only showed the ADP-ribose part implying the hydrolysis of NAD+ and the importance of NAM moiety in SRT1720 binding. In contrast to the SRT1720 inhibition mechanism, Ex-527 stabilized a closed sirtuin conformation and prevented the product 2'-O-acetyl-ADP-ribose release. Crystal structure of the complex of Sirt3/native O-alkylamidate intermediate provided more information about the deacetylation reaction.

Abstract in weiterer Sprache

Sirtuine sind eine Familie hochkonservierter Proteindeacylasen, die wichtige Regulatoren des Metabolismus, der Lebensdauer und alters-assoziierter Krankheiten sind. Säugetiere besitzen sieben Sirtuinisoformen, die sich in ihrer subzellulären Lokalisation, ihren Substraten und biologischen Funktionen unterscheiden. Drei Sirtuinisoformen, Sirt3-5, sind mitochondrial lokalisiert und spielen eine entscheidende Rolle in allen mitochondrialen Prozessen. Diese Arbeit untersucht die Modulation von niedermolekularen Wirkstoffen auf die mitochondrialen Sirtuine Sirt3 und Sirt5 mittels struktureller Charakterisierung als auch anhand biochemischer und biophysikalischer Analyse. Über Resveratrol, ein in Rotwein vorkommendes Polyphenol, ist bekannt, dass es Sirt1 aktiviert. Die Untersuchung von Resveratrol und dessen verwandten Wirkstoffen wie Piceatannol, Polydatin, 4´-Bromoresveratrol gegen Sirt3 zeigte eine inhibitorische Wirkung. Von diesen Wirkstoffen ist 4´-Bromoresveratrol der stärkste Sirt3-Inhibitor. Kristallstrukturen von Sirt3 komplexiert mit dem FdL-1-Peptid und Piceatannol/Polydatin zeigten eine direkte Interaktion dieser Wirkstoffe mit dem Coumarinring des Peptids. Dies induziert eine unproduktive Substratbindung, die dadurch die Enzymaktivität inhibiert. Kristallstrukturen der Sirt3/FdL-1/4’-bromo-resveratrol- und Sirt3/ACS2/4’-bromo-resveratrol-Komplexe offenbarten zwei unterschiedliche Wirkstoffbindestellen. Biochemische Daten und Bindungsdaten deuteten an, dass die 4’-bromo-resveratrol-Bindestelle im FdL-1-Komplex im Inhibitionsmechanismus involviert ist. Die Wirkstoffbindestelle im ACS2-Komplex hingegen könnte die Bindestelle für den Aktivierungsmechanismus von Resveratrol gegenüber Sirt1 implizieren. Wirkstoffe wie SRT1720, ein potenter synthetischer Sirt1-Aktivator, und Ex-527, ein potenter Sirt1-Inhibitor, die beide Resveratrol nicht ähneln, inhibierten auch Sirt3. In der Komplexstruktur von Sirt3/carba-NAD+/SRT1720 kompetierte der Wirkstoff mit dem Substratpeptid, indem er die Bindestelle des Acetyllysins besetzt. SRT1720 interagiert mit NAD+ und Bindestudien deuten an, dass die Nikotinamidgruppe des NAD+ für die SRT1720-Bindung essenziell ist. Im Gegensatz zum Inhibitionsmechanismus von SRT1720 stabilisiert Ex-527 die geschlossene Sirtuinkonformation und verhinderte dadurch die Freisetzung des Produkts 2´-O-acetyl-ADP-Ribose. Die Kristallstruktur des Komplexes aus Sirt3/nativem O-alkylamidat-Intermediats lieferte mehr Information über die Deacetylierungsreaktion.