Optimizing Polycationic Transfection for Improved Gene Delivery in Mammalian Cells

Titelangaben

Keim, Daniel:
Optimizing Polycationic Transfection for Improved Gene Delivery in Mammalian Cells.
Bayreuth , 2024 . - VI, 118 S.
( Dissertation, 2024 , Universität Bayreuth, Fakultät für Ingenieurwissenschaften)

Volltext

	Format: PDF Name: Dissertation Final.pdf Version: Veröffentlichte Version Verfügbar mit der Lizenz Creative Commons BY 4.0: Namensnennung
	Download (6MB)

Abstract

This work evaluates the non-viral, polycationic transfection of ARPE-19 cells and primary human B cells. Two distinct polycations are utilized: the commercially available linear l-PEI and a nanostar synthesized at the department. The study's first focus is the polycations' ability to bind negatively charged polynucleic acids, such as pDNA or mRNA, into a polyplex. Quantifying the necessary ratio of genetic material to polycation using various standard methods to ensure complete complexation. Furthermore, many experimental parameters, such as transfection volume, contact time between polyplexes and cells, and the number of polycations added, are modified and adjusted to optimize transfection efficiency for both cell types, ARPE-19 and primary B cells. Transfection efficiency and cell viability were measured using flow cytometry. Transfection efficiency is determined by detecting an expressed fluorescent protein, while cell viability is determined using propidium iodide as the staining agent. Our results indicate that for efficient condensation of genetic material with the nanostar polycation, a lower N/P ratio is required compared to l-PEI. Various analyses, such as gel retardation assay and ethidium bromide assay, were applied and showed that the nanostar could reliably bind the entire genetic material starting from an N/P ratio of 1 and l-PEI from an N/P ratio of 3. Transfecting ARPE-19 cells with polycationic transfection agents using commercially available vectors has remained challenging and not feasible. Specifically, l-PEI, a widely used polycation, proved to be inapplicable. Unlike conventional methods, where the amount of genetic material is kept constant and the amount of polycation is adjusted to achieve the desired N/P ratio, the results presented here support a different strategy. By employing a continuous amount of polycation and adjusting the amount of genetic material, significantly better results were achieved. This change is believed to minimize the cytotoxic effects of transfection since the amount of added polycation is one of the crucial factors. This revision represented the first step in significantly improving transfection efficiency for commercially available l-PEI and the in- house synthesized nanostar. Further modifications, such as a reduced transfection volume to 0.5 mL and lowering the contact time between polyplexes and cells to 2 hours, increased transfection efficiency with a maintained robust cell viability. Optimal results with l-PEI were achieved at 60 µg/10 6 cells for mRNA transfection and 40 µg/10 6 cells for pDNA transfection, both at an N/P ratio of ≥ 10. The nanostar achieved the best results at an N/P ratio of 5 and a polymer density of 60 µg/10 6 cells, regardless of the polynucleotide used. For both polycations, transfection efficiencies of about 70% were achievable using pDNA with a recovery time of 48 hours post-transfection while maintaining cell viability at about 80%. These results significantly improve over previous studies with l-PEI. Further utilization of this methodology was tested for applying the CRISPR/Cas9 system. Although it was confirmed that the established procedure could deliver transfected cells, no statistically significant difference between the CRISPR system and the control group was validated. Replacing proprietary, in- house synthesized polymers with commercially available l-PEI in future ARPE-19 cell transfection studies could enhance the applicability and accessibility of genetically modified ARPE-19 cells. As advancements continue in research and development of non-viral transfection methods, the efficient transfer of nucleic acids into primary cells, particularly immune cells, remains challenging and requires in-depth consideration. This study uses the nanostar polycation to transfect primary human B cells. By optimizing the interaction between polyplexes and cells, adjusting the amounts of polymer and plasmid, and fine-tuning the culture conditions before and after transfection, a transfection efficiency of 40% was achieved in human tonsillar B cells while maintaining reasonable cell viability of about 70%. A significant insight from the presented results suggests that the complexity and distribution of B cell subpopulations before and after transfection plays a crucial role in the process. The plasma cell subtype was identified as especially significant for transfection, demonstrated through transfection and subsequent antibody staining, indicating this subtype as the preferentially transfected portion of the B cells. Future research should focus on the influence of B cell subset dynamics before and after transfection. Additionally, a general improvement in cell viability was investigated, with the most significant effect observed when the temperature during transfection was reduced to 4 °C. This improvement is likely due to changes in cell membrane fluidity. In summary, this work could significantly enhance the transfection outcomes for both cell types, primary human B cells and the retinal cell line ARPE-19, when polycations are used as transfection agents.

Abstract in weiterer Sprache

In dieser Arbeit wurde eine detaillierte Untersuchung der nicht-viralen, polykationischen Transfektion von ARPE-19-Zellen und primären humanen B-Zellen durchgeführt. Dabei kamen zwei unterschiedliche Polykationen zum Einsatz: das kommerziell erhältliche lineare l-PEI und ein am Lehrstuhl synthetisierter Nanostern. Ein erster Untersuchungsschwerpunkt stellte die Fähigkeit der verwendeten Polykationen dar, negativ geladene Polynukleotide wie pDNA oder mRNA in einem Polyplex zu binden. Die Quantifizierung des erforderlichen Mengenverhältnisses von genetischem Material zu Polykation (N/P Verhältnis), um eine vollständige Komplexierung zu gewährleisten, erfolgte mittels verschiedener Standardmethoden. Des Weiteren wurde für die Optimierung der Transfektionseffizienz eine Vielzahl von experimentellen Parametern, wie Transfektionsvolumen, Kontaktzeit zwischen Polyplexen und Zellen sowie die Menge an zugegebenen Polykationen, verändert und angepasst. Die Transfektionseffizienz und die Zellviabilität werden mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Bestimmung der Transfektionseffizienz erfolgt über die Detektion eines exprimierten fluoreszierenden Proteins, während die Zellviabilität mittels Propidiumiodid bestimmt wurde. Unsere Ergebnisse zeigten, dass für eine effiziente Kondensation des genetischen Materials mit dem Nanostern-Polykation ein niedrigeres N/P-Verhältnis notwendig war als für l-PEI. Verschiedene Analysen, wie das Gel-Retardationsassay und Ethidiumbromid-Assay, wurden angewendet und zeigten, dass der Nanostern ab N/P = 1 und l-PEI ab N/P = 3 zuverlässig das gesamte genetische Material binden konnten. Die Transfektion von ARPE-19-Zellen mit polykationischen Transfektionsagenzien unter Verwendung kommerziell erhältlicher Vektoren stellte bis heute eine bachtliche Herausforderung dar. Insbesondere die Nutzung von l-PEI, einem weit verbreiteten Polykation, erwies sich als nicht anwendbar. Im Gegensatz zur konventionellen Methodik, bei der die Menge des genetischen Materials konstant gehalten und die Menge des Polykations angepasst wird, um das gewünschte N/P-Verhältnis zu erreichen, befürworten die hier präsentierten Ergebnisse eine andere Strategie. Durch den Einsatz einer gleichbleibenden Menge an Polykation und Anpassung der Menge an genetischem Material konnten deutlich bessere Resultate erzielt werden. Es wird angenommen, dass diese Änderung die zytotoxischen Effekte der Transfektion minimieren kann, da die Menge des zugegebenen Polykations die entscheidende Größe dafür sei. Diese Änderung stellte den ersten Schritt dar, um eine erhebliche Verbesserung der Transfektionseffizienz sowohl für das kommerziell erhältliche l-PEI als auch für den Nanostern zu erzielen. Weitere Modifikationen wie die Reduktion des Transfektionsvolumens auf 0.5 mL und die Verringerung der Kontaktzeit zwischen Polyplexen und Zellen auf 2 h führten zu weiteren Steigerungen der Transfektionseffizienz bei zufriedenstellender Zellviabilität. Optimale Ergebnisse mit l-PEI wurden bei 60 µg/10 6 Zellen für die mRNA-Transfektion und 40 µg/10 6 Zellen für die pDNA-Transfektion erzielt, beide bei einem N/P-Verhältnis von ≥ 10. Der Nanostern erreichte die besten Ergebnisse bei einem N/P-Verhältnis von 5 und einer Polymerdichte von 60 µg/10 6 Zellen, unabhängig vom verwendeten genetischen Material. Für beide Polykationen waren Transfektionseffizienzen von etwa 70 % bei Verwendung von pDNA und einer Erholungszeit von 48 h nach Transfektion erreichbar, wobei die Zellviabilität bei etwa 80 % gehalten werden konnte. Diese Ergebnisse stellen eine erhebliche Verbesserung im Vergleich zu früheren Studien mit l-PEI dar und bedeuten einen vielversprechenden Fortschritt in der polykationischen Transfektion. Die weitere Nutzung dieser Methodik wurde für die Anwendung des CRISPR/Cas9-Systems getestet. Obwohl bestätigt wurde, dass das etablierte Verfahren transfizierte Zellen liefern konnte, wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen dem CRISPR-System und der Kontrollgruppe validiert. Der Ersatz von proprietären, hausintern synthetisierten Polymeren durch kommerziell erhältliches l-PEI in zukünftigen ARPE-19-Zelltransfektionsstudien könnte die Anwendbarkeit und Zugänglichkeit von genetisch modifizierten ARPE-19 Zellen erweitern. Im Zuge der Fortschritte in Forschung und Entwicklung nicht-viraler Transfektionsmethoden bleibt der effiziente Transfer von Nukleinsäuren in Primärzellen, insbesondere Immunzellen, eine schwierige Herausforderung, die eine differenzierte Betrachtung erfordert. In dieser Studie wird der Nanostern für die Transfektion von primären humanen B-Zellen benutzt. Durch die Optimierung der Interaktion zwischen Polyplexen und Zellen, die Anpassung der Mengen von Polymer und Plasmid sowie die Feinabstimmung der Kulturbedingungen vor und nach der Transfektion erreichten wir eine Transfektionseffizienz von 40 % in humanen Tonsillar-B- Zellen bei gleichzeitig angemessener Zellviabilität von etwa 70 %. Eine bedeutende Erkenntnis der hier präsentierten Ergebnisse deutet darauf hin, dass die Komplexität und Verteilung der B- Zell-Subpopulationen vor und nach der Transfektion eine wichtige Rolle im Prozess spielen können. Insbesondere der Plasmazell-Subtyp zeigte sich für die Transfektion von besondererBedeutung, es konnte durch Transfektion und anschließender Antikörperfärbung nachgewiesen werden, dass dieser Subtyp den präferenziell transfizierten Teil der B-Zellen darstellt. Nachfolgende Forschungen sollten sich auf den Einfluss der B-Zell-Subset-Dynamik vor und nach der Transfektion konzentrieren und eine Transfektionseffizienz-Abhängigkeit von der Plasmazellpopulation aufdecken. Zusätzlich wurde eine allgemeine Verbesserung der Zellviabilität untersucht, der bedeutsamste Effekt konnte beobachtet werden, als die Temperatur während der Transfektion auf 4 °C reduziert wurde. Diese Verbesserung ist wahrscheinlich auf Veränderungen in der Fluidität der Zellmembran und erhöhte Rigidität zurückzuführen. Diese Arbeit hat einen neuartigen Ansatz für die nicht-virale Transfektion von primären humanen B-Zellen entwickelt. Mehrere kritische Parameter wurden identifiziert, um den Bedarf an hoher TE und Zellviabilität anzusprechen. Zukünftige Studien sollten sich mehr auf die Transfektion spezifischer Subsets konzentrieren.