Construction and analysis of novel controllable expression vectors for Bacillus subtilis

Titelangaben

Phan, Thi Phuong Trang:
Construction and analysis of novel controllable expression vectors for Bacillus subtilis.
Bayreuth , 2007
( Dissertation, 2007 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Summary The gram-positive bacterium Bacillus subtilis is well-known for its contributions to agricultural, medical, and food biotechnology and for the production of recombinant proteins. At present, about 60% of the commercially available technical enzymes are produced by Bacillus species. Furthermore, a large body of information concerning transcription, translation, protein folding and secretion mechanisms, genetic manipulation, and large-scale fermentation has been acquired. But so far, efficient and inexpensive expression vectors for B. subtilis are still missing. To fill this gap, a glycine-inducible expression system and a lysine-autoinducible one were explored and IPTG-inducible expression plasmids that allow overexpression and purification of proteins were constructed and analyzed. Furthermore, a technique with a useful promoter-probe plasmid to analyze strong promoters in B. subtilis was established, which allowed to study promoter and mRNA stabilizing elements to enhance the transcript level and mRNA stability leading to higher production of recombinant protein. During the development of the glycine-inducible and lysine-autoinducible expression plasmids, the presence of a small transcript termed riboswitch corresponding to the 5´ UTR in the absence of L-glycine or presence of L-lysine and its conversion into the full-length transcript after addition of the L-glycine or removal of L-lysine was confirmed by Northern blot. Next, the promoter and downstream riboswitch was fused to the lacZ reporter gene to measure glycine or lysine-dependent induction. The production potential for the glycine system was analyzed in detail, and the promoter strength improved by using HtpG, Pbp4 and alpha-amylase as model proteins. In summary, the glycine riboswitch can be used successfully for regulatable production of both intra- and extracellular proteins, and the lysine riboswitch can be applied as an auto-inducible expression system allowing production of recombinant proteins when the L-lysine concentration within the growth medium falls below a threshold value. Six commercially available novel plasmid-based IPTG-inducible expression plasmids for B. subtilis were constructed, too. While the first vector allows intracellular production of recombinant proteins (pHT01), the second provides a strong secretion signal (pHT43). The third vector allows addition of the c-Myc epitope tag (pHT10), and the remaining three vectors provide the purification tags His (pHT08) and Strep (pHT09 and pHT24). The versatility of all six vectors was verified by insertion of appropriate reporter genes and by demonstrating high level production of their proteins. A total of 85 different synthetic and groE-modified sigmaA-dependent promoters were introduced into pHT06 and analyzed. Sequences around the transcriptional start site, the -10 region, the -15 region, the -35 region and the upstream region turned out to influence the promoter strength. BgaB activities and Northern blot analyses were used to measure the activity of the different promoters. The measurements of some new combinations of core promoters and UP elements on gene expression revealed that the beta-galactosidase activity expression levels could be increased up to 13-fold and the mRNA levels up to 43-fold as compared to the strong Pgrac promoter. If both elements were combined, an activity roughly 690 times higher than that obtained with the Pspac promoter were obtained, and synthesis of BgaB, under control of these promoters, could reach up to 30% of the total cellular protein. The mRNA stabilizing elements were also analyzed by using a similar experimental approach. First, seven-teen different 3´-mRNA terminal stem-loops have been investigated, which did not significantly influence neither the amount of protein produced nor the mRNA stability. Second, the 5´-mRNA stabilizing elements including a strong RBS, the lacO Controllable Stabilizing Element (CoSE) and the spacer between the RBS and CoSE were examined. The results demonstrated that CoSE together with an appropriate spacer and a strong RBS could increase gene expression 9-fold as compared to the Pgrac promoter, reaching up to 26% of total cellular protein and a half-life of the mRNA of more than 60 min. A combination of strong promoters and stabilizing elements showed that recombinant protein synthesis levels of up to 42% of the total cellular protein could be obtained.

Abstract in weiterer Sprache

Zusammenfassung Das Gram-positive Bakterium Bacillus subtilis spielt eine wichtige Rolle im Bereich der Landwirtschaft, der Medizin und der Ernährung und bei der Produktion rekombinanter Proteine. Momentan werden etwa 60% aller kommerziell verfügbaren technischen Enzyme von Bacillus-Spezies produziert. Außerdem sind eine Vielzahl von Informationen über die Transkription, die Translation, die Protein-Faltung, die Sekretions-Mechanismen, die genetische Manipulation und die Fermentation im industriellen Maßstab verfügbar. Dem steht gegenüber, dass effiziente und preiswerte Expressions-Vektoren bislang fehlen. Um diese Lücke zu schließen, wurden ein Glycin-induzierbares und ein Lysin-autoinduzierbares Expressionssystem entwickelt. Ferner wurden IPTG-induzierbare Expressions-Vektoren konstruiert und analysiert, die Überexpression und Reinigung von Proteinen erlauben. Weiterhin wurde ein Promoter-Testvektor entwickelt, der die Analyse von sehr starken Promotoren sowie von mRNA stabilisierenden Elementen erlaubt, um die Menge an Transkript und die mRNA-Stabilität zu erhöhen und damit eine höhere Produktion an rekombinanten Proteinen zu gewährleisten. Während der Entwicklung der Glycin- und Lysin-induzierbaren Vektoren wurde mittels Northern-Blot bestätigt, dass in beiden Fällen zunächst ein kurzes Transkript, genannt Riboswitch, synthetisiert wird, welches nach Zugabe von Glycin und nach Entfernen von Lysin in ein längeres Transkript umgewandelt wird. Um die Expressionsstärke nach Induktion zu quantifizieren, wurden die beiden Promotoren mit ihren Riboswitches an das lacZ-Reportergen fusioniert. Im Falle des Glycin-Systems wurde der Promotor optimiert und die Produktion von HtpG, Pbp4 und alpha-Amylase als Modellproteine analysiert. Diese Ergebnisse zeigten, dass der Glycin-Riboswitch erfolgreich für die regulierte Produktion von sowohl intra- als auch extrazellulären Proteinen und der Lysin-Riboswitch als autoinduzierbares System verwendet werden können. Im letzteren Fall beginnt die Produktion der rekombinanten Proteine, wenn die Lysin-Konzentration in der Zelle unter einen Schwellenwert gefallen ist. Außerdem wurden sechs verschiedene neuartige IPTG-induzierbare Expressions-Vektoren für B. subtilis konstruiert. Während der erste Vektor die intrazelluläre Produktion von rekombinanten Proteinen erlaubt (pHT01), enthält der zweite ein starkes Sekretions-Signal (pHT43). Der dritte Vektor erlaubt das Anfügen des c-Myc Epitop-Tags (pHT10), und die restlichen drei Vektoren das Anfügen der His- (pHT08) und Strep-Reinigungs-Tags (pHT09 und pHT24). Die Anwendung aller sechs Vektoren wurde durch das Einklonieren geeigneter Reportergene und die nachfolgende Überproduktion ihrer Proteine gezeigt. Insgesamt 85 verschiedene und PgroE-modifizierte sigmaA-abhängige Promotoren wurden in pHT06 kloniert and analysiert. Es zeigte sich, dass DNA-Sequenzen um den Transkriptionsstart, die -10-, die -15- und die -35-Region und upstream vom Promotor dessen Stärke beeinflussen. Um die Aktivität der verschiedenen Promotoren zu vergleichen, wurden die BgaB-Aktivitäten bestimmt und Northern-Blot-Experimente durchgeführt. Die Messungen einiger neuer Kombinationen von Core-Promotoren und UP-Elemente zeigten, dass die beta-Galaktosidase-Aktivitäten jeweils bis zu 13-fach bzw. 43-fach gesteigert werden konnten im Vergleich mit dem bereits starken Pgrac-Promotor. Wurden beide Elemente kombiniert, dann wurde eine etwa 690-fache Aktivität, wieder bezogen auf den Pgrac-Promotor, gemessen, und die Synthese an BgaB-Protein erreichte bis zu 30% des gesamten zellulären Proteins. Die mRNA-stabilisierenden Elemente wurden mit einem vergleichbaren experimentellen Ansatz untersucht. Zunächst wurden 17 verschiedene Stem-Loop-Strukturen am 3´-Ende der mRNA analysiert. Keine dieser DNA-Sequenzen zeigten einen signifikanten Einfluss auf die Menge an synthetisiertem Protein. Dann wurden 5´-mRNA-stabilisierende Elemente analysiert, und zwar eine starke RBS, ein lacO-kontrollierbares stabilisierendes Element (genannt CoSE) und die Spacer-Regionen zwischen RBS und CoSE. Diese Ergebnisse zeigten, dass das CoSE-Element zusammen mit einem geeigneten Spacer und einer starken RBS die Genexpression 9-fach steigern konnte, wieder bezogen auf den Pgrac-Promotor. Dies führtezn bis zu 26% an rekombinantem Protein und einer Halbwertszeit der mRNA von mehr als 60 min. Eine Kombination von starken Promotoren und stabilisierenden Elementen führtezn bis zu 42% an rekombinantem Protein als Anteil am Gesamtprotein.