Clinical relevance of circulating epithelial tumor cells (CETCs) and circulating cancer stem cells (cCSCs) during different therapies of breast cancer patients

Titelangaben

Schott, Dorothea Sonja:
Clinical relevance of circulating epithelial tumor cells (CETCs) and circulating cancer stem cells (cCSCs) during different therapies of breast cancer patients.
Bayreuth , 2022 . - X, 177 S.
( Dissertation, 2022 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Der schwerwiegendste Aspekt maligner Tumore ist ihre Fähigkeit Fernmetastasen in lebenswichtigen Organen zu bilden. Bei der Mehrheit neudiagnostizierter solider maligner Tumore liegen zum Zeitpunkt der Diagnose keine Metastasen vor. Dennoch erleiden bis zu 50% der Patienten ein Rezidiv. Dies beruht auf der Disseminierung von Tumorzellen, die dann Metastasen im Sekundärgewebe bilden können. Jedoch können nicht alle disseminierten Tumorzellen zu Metastasen in distanten Organen heranwachsen. Eine kleine Subpopulation von Zellen, die ein hohes Selbsterneuerungspotential besitzt, scheint für die Entstehung von Tumoren und Rezidive verantwortlich zu sein. Diese Subpopulation wird als Krebsstammzellen oder Tumor-initiierende Zellen bezeichnet. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnte mit einem neuartigen 3D-Zellkultursystem die aggressivste Subpopulation der CETCs, die zirkulierenden Krebsstammzellen, die in-vitro zu Tumorsphären heranwachsen, identifiziert und weiter charakterisiert werden. Immunfluorimetrische, als auch genetische Untersuchungen konnten zeigen, dass sie Stammzelleigenschaften besitzen, die typisch für das Mammakarzinom sind. Die Anzahl an cCSCs spiegelte direkt die Aggressivität des Tumors wider und konnte das Risiko für Fernmetastasen bestimmen. Die Entwicklung eines patient-derived Xenograft Modells konnte zudem die Tumorigenität der in-vitro kultivierten Tumorsphären erstmals beweisen. Nach ihrer Applikation auf die Chorioallantoismembran des Hühnerembryos konnten sie innerhalb kürzester Zeit einen Tumor generieren, der pathologisch dem Primärtumor entsprach. Diese neu entwickelten Modelle konnten die Existenz der Krebsstammzellen nicht nur im Tumorgewebe sondern auch im peripheren Blut der Krebspatienten bestätigen und deren klinische Relevanz verdeutlichen. Dies eröffnet einen Weg Tumor-initiierende Zellen in unterschiedlichen Tumorentitäten zu identifizieren, molekular zu charakterisieren und zielgerichtete Therapien zu entwickeln. CETCs sind einer Reihe unterschiedlicher physiologischer und immunologischer Hürden ausgesetzt, die deren Überleben im peripheren Blut erschweren. Um sich vor der Eliminierung durch das Immunsystem erfolgreich zu schützen, nutzen die CETCs eine Vielzahl unterschiedlicher Strategien. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die unterschiedlichen Mechanismen untersucht, mit denen sich die CETCs vor der Immunüberwachung tarnen können. Im Fokus der Immunonkologie stehen die sogenannten checkpoints des Immunsystems, die von den T-Zellen exprimiert werden und normalerweise eine überbordende Immunreaktion verhindern. Tumorzellen können sich diesen Mechanismus der Immunevasion zu Nutze machen. In dieser Arbeit konnte mit Hilfe immunfluorimetrischer und molekularzytogenetischer Analysen gezeigt werden, dass die CETCs bestimmte checkpoints wie PD-L1 und B7-H3 in einem hohen Prozentsatz auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Dies ermöglicht ihr Überleben im peripheren Blut und fördert gleichzeitig die metastatische Ausbreitung des Tumors. Eine Blockade dieser checkpoints bereits in frühen Stadien könnte klinisch relevant sein, um die Immunantwort, die sich gegen die Tumorzellen richtet, zu reaktivieren. Das Monitoring PD-L1 und B7-H3 positiver CETCs könnte insbesondere nach der operativen Entfernung des Tumors für die Überwachung der Immuntherapie nützlich sein. Ein weiterer Mechanismus, der die CETCs im peripheren Blut vor immunologischen Angriffen, den Scherkräften des Blutes und der Apoptose schützt, ist deren Interaktion mit anderen Komponenten des Blutes. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass Thrombozyten eine entscheidende Rolle dabei spielen, das Überleben der CETCs im Blutkreislauf zu fördern. Die Tumorzell-induzierte Thrombozytenaggregation schützt die CETCs vor den Scherkräften des Blutes und gleichzeitig vor einer immunologischen Eliminierung. Dies kann jedoch auch der Grund dafür sein, dass die Antikörper die Oberflächenantigene der Tumorzellen nicht erreichen. In dieser Arbeit konnte die Interaktion zwischen den CETCs und den Thrombozyten zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach der Blutentnahme bestätigt werden. Die Tumorzellen bildeten im Blut Aggregate mit den Thrombozyten, wodurch ihr Überleben im peripheren Blut gefördert, jedoch gleichzeitig deren Nachweis unmittelbar nach der Blutentnahme erschwert wurde. Durch die Lagerung der Blutproben über Nacht bei Raumtemperatur kam es zur Ablösung der Thrombozyten von den CETCs, wodurch sie mittels Immunfluoreszenz identifiziert werden konnten. Die Wirkung von Thrombozytenaggregationshemmern könnte einen inhibierenden Einfluss auf den Metastasierungsprozess haben. CETCs stellen wertvolle tumorspezifische Biomarker dar, die die verbliebene minimale Resterkrankung nach einer scheinbar erfolgreich abgeschlossenen Krebstherapie widerspiegeln. Zudem können sie zeitnah die Effizienz systemischer Therapien abbilden, wodurch sie eine prognostische Relevanz haben. Aufgrund der hohen intra- und intertumoralen Heterogenität, aber auch aufgrund möglicher Veränderungen der Tumorzelleigenschaften im Krankheitsverlauf ist die longitudinale Überwachung der zirkulierenden Tumorzellen von großer Bedeutung. Frühe Resistenzen, bzw. frühzeitige Rezidive lassen sich somit leicht verfolgen. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit konnte mit der maintrac® Methode veranschaulicht werden, dass die Quantifizierung der CETCs und vor allem der cCSCs ein geeignetes Stadien-unabhängiges Verfahren darstellt, um die Effizienz der aktuellen Therapie, wie der Immuntherapie, der Radiotherapie und der endokrinen Therapie zu überwachen. Patientinnen mit einem erhöhten Risiko für eine Therapieresistenz und ein Rezidiv könnten somit frühzeitig identifiziert und die Behandlungsstrategie angepasst werden. Die molekularbiologische Charakterisierung der Zellen hinsichtlich therapierelevanter Marker wie PD-L1, B7-H3 und AR bzw. ER könnte bei der Patientenstratifizierung für eine personalisierte Therapie behilflich sein.

Abstract in weiterer Sprache

The most pernicious aspect of malignant tumors is their ability to form distant metastases in vital organs. In the majority of newly diagnosed solid malignant tumors, no metastases are present at the time of diagnosis. Nevertheless, up to 50% of patients suffer a recurrence. This is due to the dissemination of tumor cells, which can form metastases in secondary tissue. However, not all disseminated tumor cells can grow into metastases in distant organs. A small subpopulation of cells with a high self-renewal potential seems to be responsible for the development of tumors and recurrences. This subpopulation is referred to as cancer stem cells or tumor-initiating cells. In the first part of the present work, a novel 3D cell culture system was used to identify and further characterize this most aggressive subpopulation of CETCs, the circulating cancer stem cells that can grow into tumorspheres in vitro. Immunohistochemical as well as genetic analyses have shown that they express stem cell characteristics typical for breast carcinoma. The number of cCSCs directly reflected the aggressiveness of the tumor and determined the risk of distant metastases. The development of a patient-derived xenograft model demonstrated the tumorigenicity of tumorspheres cultured in-vitro from patient blood. After their application to the chick embryo chorioallantoic membrane they were able to generate a tumor pathologically equivalent to the primary tumor within a very short time. These newly developed models were able to confirm the existence of cancer stem cells not only in tumor tissue but also in the peripheral blood of cancer patients. This opens a way to identify tumor-initiating cells in different tumor entities, characterize them molecularly and develop targeted therapies. CETCs are exposed to a number of different physiological and immunological hurdles that impede their survival in peripheral blood. To successfully evade elimination by the immune system, CETCs use a variety of different strategies. In the second part of the present work, the different mechanisms by which CETCs succeed in protecting themselves from elimination by the immune system were investigated. Immuno-oncology focuses on the so-called checkpoints of the immune system, which are expressed by T cells and normally prevent an exuberant immune response. Tumor cells can succeed in exploiting this mechanism to evade the activated immune system. In this work, immunofluorimetric and molecular cytogenetic analyses demonstrated that CETCs express certain checkpoints such as PD-L1 and B7-H3 in a high percentage on their cell surface. This enables their survival in the peripheral blood while promoting metastatic spread of the tumor. Blocking these checkpoints at early stages could be clinically relevant to reactivate the immune response directed against tumor cells. Monitoring PD-L1 and B7-H3 positive CETCs could be useful for monitoring immunotherapy especially after surgical removal of the tumor. Another mechanism that protects CETCs in the peripheral blood from immunological attack, blood shear forces, and apoptosis is their interaction with other components of the blood. Recent studies suggest that platelets play a crucial role in promoting the survival of CETCs in the bloodstream. Tumor cell-induced platelet aggregation protects the CETCs not only from the shear forces of the blood but simultaneously from immunological elimination. This protective shield may also be the reason why the antibodies do not reach the surface antigens of the tumor cells. In this work, the interaction between CETCs and platelets was confirmed at three different time points after blood collection. The tumor cells formed aggregates with the platelets in the blood, promoting their survival in the peripheral blood, but at the same time making their detection more difficult immediately after blood collection. Storage of blood samples overnight at room temperature resulted in detachment of platelets from CETCs, allowing their identification by immunohistochemistry. The effect of platelet aggregation inhibitors could have an inhibitory influence on the metastasis process. CETCs represent valuable tumor-specific biomarkers that reflect the remaining minimal residual disease after an apparently successfully completed cancer therapy. In addition, they can promptly show the efficacy of systemic therapies, thus having prognostic relevance. Due to the high intra- and intertumoral heterogeneity, but also due to possible changes in tumor cell properties during disease progression, longitudinal monitoring of circulating tumor cells is of high importance. Early resistance, or early recurrence, can thus be easily tracked. In the third part of the present work, the maintrac® approach was used to demonstrate that quantification of CETCs and especially cCSCs is a suitable stage-independent method to monitor the efficacy of current therapy, such as immunotherapy, radiotherapy and endocrine therapy. Patients at increased risk for treatment resistance and recurrence could be identified early and the treatment strategy adjusted. Molecular characterization of these cells with respect to therapy-relevant markers such as PD-L1, B7-H3, and AR or ER could be useful in patient stratification for personalized therapy.