Biocide tolerance and antibiotic cross-resistance in human pathogenic bacteria

Titelangaben

Rödel, Alice:
Biocide tolerance and antibiotic cross-resistance in human pathogenic bacteria.
Bayreuth , 2022 . - IX, 131 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Biocides are applied to control harmful organisms. Especially the use of microbicides as disinfectants is a vital tool to prevent the spread of multidrug-resistant human pathogenic bacteria. Due to the increased use of disinfectants in recent years, concerns have been raised about biocide tolerance and the development of antibiotic cross-resistance. In vitro studies indicate biocide use as a risk factor for the emergence of antibiotic resistance. Still, a causal link between biocide usage and antibiotic resistance development in environmental settings needs to be verified. Thus, this thesis pursued three main objectives (I-III). The controversial current knowledge on the potential of bacteria to develop biocide tolerance and/or antibiotic resistance in response to biocide exposure was analyzed (objective I). Potential associations between biocide tolerance and antibiotic resistance, and underlying genetic determinants in field isolates were examined (objective II). The final aim of this thesis was to develop a ready-to-use test system enabling fast and accurate biocide susceptibility testing of bacteria (objective III). For the first aim, 78 in vitro biocide adaptation studies were evaluated. While literature demonstrated the general linkage between biocide exposure and antimicrobial cross-resistance, the potential of biocide–induced resistance development varied largely between biocides, bacterial target organisms, and experimental settings. Stable adaptation to biocides as well as altered antibiotic susceptibility profiles was frequently reported for biguanides, phenols, and quaternary ammonium compounds (QACs). For the second aim, comprehensive analyses were conducted of isolates from food (Listeria monocytogenes, n=93), livestock (Escherichia coli, n=93), and clinical environments (Enterococcus faecium, n=90) in Germany. Biocide and antibiotic susceptibility were determined for all isolates by broth microdilution methods according to ISO 20776-1. To differentiate susceptible isolates from those with reduced susceptibility to biocides, minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum bactericidal concentrations (MBC) representing 95% of the tested population (MIC95, MBC95 values) served as tentative epidemiological cut-offs. Underlying genetic determinants were detected by whole genome sequencing for L. monocytogenes and E. coli. The overall proportion of isolates with reduced biocide susceptibility was relatively low, and statistically significant phenotypic associations to antibiotic resistance were not found. However, genotypic associations were observed in E. coli. Biocide tolerance conferring genes co-located close to antibiotic resistance genes on plasmids were identified, highlighting the potential for co-selection. Biocide susceptibility of all tested isolates was well below in-use concentrations. That is why they are defined as non-resistant. Identified tolerances were associated with genetic determinants in several cases. Reduced susceptibility to QACs in L. monocytogenes could be mainly traced back to genes coding for small multidrug-resistance family efflux pumps. E. coli isolates with reduced formaldehyde susceptibility carried the gene coding for the degradative enzyme glutathione- and NAD-dependent formaldehyde dehydrogenase. In contrast to antibiotic susceptibility testing, no generally accepted, standardized biocide susceptibility test methods are available. Thus, the third aim was to establish a reliable, high-throughput screening system using vacuum dried biocide microtiter plates to identify bacteria resistant to cationic biocides frequently used in hospital settings. The developed test system was validated against the broth microdilution method using freshly prepared stocks of biocides. Biocide plates were evaluated for gram-positive Enterococcus spp. as well as gram-negative E. coli. This test system has been shown to provide highly reliable results. Subsequently, the test method served for the third susceptibility study of E. faecium from the clinical environment. The test system proved to be a fast and easy-to-handle surveillance tool to identify biocide tolerant isolates. Monitoring and early identification of clinical isolates tolerant to disinfectants applied in hospitals could help to adapt hygiene measures and control nosocomial infections while simultaneously reducing the frequency of antibiotic treatment.

Abstract in weiterer Sprache

Biozide werden zur Bekämpfung von Schadorganismen eingesetzt. Insbesondere der Einsatz von Mikrobiziden als Desinfektionsmittel ist eine wichtige Maßnahme, um die Ausbreitung multiresistenter, humanpathogener Bakterien zu verhindern. Aufgrund des verstärkten Einsatzes von Desinfektionsmitteln in den letzten Jahren sind jedoch Bedenken hinsichtlich Biozidtoleranzen und der Entwicklung von Antibiotikakreuzresistenzen aufgekommen. In vitro Studien deuten darauf hin, dass Biozide Antibiotikaresistenzen fördern. Ein kausaler Zusammenhang zwischen der Verwendung von Bioziden und der Entwicklung von Antibiotikaresistenzen in der Umwelt muss jedoch noch verifiziert werden. Daher verfolgte die These drei Hauptziele (I-III). Es wurde das aktuelle, kontroverse Wissen über das Potenzial von Bakterien Biozidtoleranzen und/oder Antibiotikaresistenz unter Biozidexpositionen auszubilden analysiert (Ziel I). Des Weiteren wurden mögliche Zusammenhänge zwischen Biozidtoleranz und Antibiotikaresistenz sowie die zugrunde liegenden genetischen Determinanten in Feldisolaten untersucht (Ziel II). Zudem sollte in dieser Arbeit ein gebrauchsfertiges Testsystem entwickelt werden, welches eine schnelle und genaue Biozidempfindlichkeitsprüfung von Bakterien ermöglicht (Ziel III). Zur Erfüllung der ersten Zielstellung wurden 78 in vitro Biozidadaptionsstudien ausgewertet. Während die Literatur den allgemeinen Zusammenhang zwischen Biozidexposition und antimikrobieller Kreuzresistenz belegt, variierte das Potenzial der biozidinduzierten Resistenzentwicklung stark zwischen Bioziden, bakteriellen Zielorganismen und experimentellen Bedingungen. Stabile Anpassung an Biozide sowie veränderte Antibiotikaempfindlichkeitsprofile wurden häufig für Biguanide, Phenole und quaternäre Ammoniumverbindungen (QACs) berichtet. Für das zweite Ziel wurden umfassende Analysen durchgeführt, die Isolate aus Lebensmittel- (Listeria monocytogenes, n=93), Nutztier-(Escherichia coli, n=93) und klinischer Umgebung (Enterococcus faecium, n=90) in Deutschland einschlossen. Die Biozid- und Antibiotikaempfindlichkeit wurde für alle Isolate mittels Mikrodilutionsverfahren gemäß ISO 20776-1 bestimmt. Um empfindliche Isolate von solchen mit verminderter Biozidempfindlichkeit zu unterscheiden, dienten minimale Hemmkonzentrationen (MIC) und minimale bakterizide Konzentrationen (MBC), die 95% der getesteten Population repräsentieren (MIC95-, MBC95-Werte), als vorläufig abgeleitete epidemiologische Cut-Off-Werte. Zugrundeliegende genetische Determinanten wurden mittels Ganzgenomsequenzierung für L. monocytogenes und E. coli nachgewiesen. Der Gesamtanteil der Isolate mit reduzierter Biozidempfindlichkeit war relativ gering und es wurden keine statistisch signifikanten phänotypischen Assoziationen zur Antibiotikaresistenz gefunden. Allerdings wurden bei E. coli genotypische Assoziationen beobachtet. Biozidtoleranz verleihende Gene wurden in der Nähe von Antibiotikaresistenzgenen identifiziert, die auf Plasmiden kolokalisiert sind, was das Potenzial für eine Ko-Selektion hervorhebt. Die Biozidempfindlichkeit aller getesteten Isolate befand sich deutlich unter den in der Praxis verwendeten Konzentrationen. Daher wurden diese Isolate als nicht resistent definiert. Identifizierte Toleranzen wurden in mehreren Fällen mit genetischen Determinanten in Verbindung gebracht. Eine reduzierte Empfindlichkeit gegenüber QACs in L. monocytogenes konnte hauptsächlich auf Gene zurückgeführt werden, die für die Small Multidrug Resistance – Familie kodieren. E. coli-Isolate mit reduzierter Formaldehydempfindlichkeit trugen ein Gen, welches für das degradierende Enzym der Glutathion- und NAD-abhängige Formaldehyd-Dehydrogenase kodiert. Im Gegensatz zur Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung gibt es für Biozidempfindlichkeitstests keine standardisierten Methoden. Daher wurde als drittes Ziel ein zuverlässiges Screening-System etabliert, das auf vakuumgetrockneten Biozidmikrotiterplatten basiert und Bakterien identifiziert, die reduzierte Empfindlichkeiten gegenüber kationischen Bioziden aufweisen. Diese vakuumgetrockneten Biozidplatten wurden mit Hilfe von etablierten Mikrodilutionsmethoden unter Verwendung frisch hergestellter Biozidlösungen validiert. Die Biozidplatten wurden sowohl für gram-positive Enterococcus spp. als auch für gram-negative E. coli ausgewertet. Insgesamt konnte nachgewiesen werden, dass dieses Testsystem sehr zuverlässige Ergebnisse lieferte. Anschließend diente die Testmethode für die dritte Empfindlichkeitsstudie von E. faecium aus dem klinischen Umfeld. Das Testsystem erwies sich als ein schnelles und einfach zu handhabendes Überwachungsinstrument zur Identifizierung biozidtoleranter Isolate. Die Überwachung und frühzeitige Identifizierung von klinischen Isolaten, die gegenüber den in Krankenhäusern eingesetzten Desinfektionsmitteln tolerant sind, könnte dazu beitragen, Hygienemaßnahmen anzupassen und nosokomiale Infektionen zu kontrollieren sowie gleichzeitig die Häufigkeit von Antibiotikabehandlungen zu reduzieren.