Biochemische und strukturelle Charakterisierung der Regulation von Sirtuinen durch AROS und Kleinmoleküle

Titelangaben

Weiß, Sandra:
Biochemische und strukturelle Charakterisierung der Regulation von Sirtuinen durch AROS und Kleinmoleküle.
Bayreuth , 2021 . - XV, 122 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Sirtuine sind eine evolutionär hoch konservierte Familie der Histon-Deacetylasen. Sie katalysieren die Deacylierung von Acyllysinresten in Substratproteinen durch einen einzigartigen Mechanismus, der NAD+ als Cosubstrat benötigt. Dies macht Sirtuine zu metabolischen Sensoren. Diese Enzyme regulieren Stressreaktionen und Alterungsprozesse. Da sie in altersbedingten und metabolischen Erkrankungen involviert sind, ist die Regulation von Sirtuinen von medizinischem Interesse und besitzt therapeutisches Potenzial. In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur endogenen Regulation von Sirtuinen durch das Protein AROS und zur Sirtuinmodulation durch Kleinmoleküle gewonnen. Das Pflanzenflavonoid Quercetin hat im Gegensatz zur Sirt6-spezifischen Aktvierung eine inhibitorische Wirkung auf die anderen Sirtuinisoformen. Die molekularen Grundlagen der Quercetin-vermittelten Inhibition konnte mit Hilfe einer Kristallstruktur des Sirt2/Quercetin-Komplexes aufgeklärt werden. So inhibiert der Naturstoff die Sirtuinaktivität durch Bindung am Eingang des aktiven Zentrums und daraus resultierender Kompetition mit dem acylierten Substrat. In Sirt6 wird diese Bindungsstelle durch den N-Terminus des Proteins besetzt. Die Sirt2-Quercetinbindungsstelle ist in Sirt6 nicht zugänglich. Quercetin bindet stattdessen in einer Sirt6-spezifischen Bindungstasche. Die Sirt2/Quercetin-Struktur trägt dazu bei, den Sirt6-spezifische Aktivierungseffekt von Quercetin zu erklären und liefert somit Informationen zur Weiterentwicklung von Sirt6-spezifischen, potenten Modulatoren. Die Erkenntnisse der Quercetin-Bindung in Sirt2 könnten zudem zur Entwicklung neuer Quercetin-basierender Inhibitoren beitragen. Neben der Regulation von Sirt6 und Sirt2 steht auch die Aktivierung von Sirt3 im Fokus. Als einziges Sirtuin mit robuster Deacetylaseaktivität im Mitochondrium gilt es als vielversprechendes Ziel zur pharmakologischen Modulation durch Aktivatoren. Aufgrund des Mangels an Sirt3-Aktivatoren wurde durch kristallografisches Screening einer Fragment-Bibliothek nach neuen Modulatoren für Sirt3 gesucht. Auf diese Weise konnten zwei neue Liganden sowie drei bisher unbekannte Liganden-Bindungsstellen für Sirt3 gefunden werden. Aufbauend auf diesen Fragmentgerüsten könnten Kleinmoleküle entwickelt werden, die Potential zur Modulation der Sirt3-Aktivität besitzen. Das Protein AROS wurde zunächst als bisher einziger endogener Aktivator von Sirt1 beschrieben. Dem widersprechend wurde von anderen Autoren eine inhibierende Wirkung von AROS auf die Sirt1-Deacetylaseaktivität festgestellt. Das Verständnis des Regulationsmechanismus von Sirt1 durch AROS könnte zur Entwicklung pharmakologischer Modulatoren beitragen. In dieser Arbeit konnte das Protein AROS zum ersten Mal charakterisiert werden. AROS akkumuliert exprimiert in E. coli in Einschlusskörpern. Daher wurde ein Renaturierungsprotokoll etabliert, welches in löslichem, reinem Protein resultierte. AROS konnte als ein flexibles Protein ohne stabile Tertiärstruktur aber mit Sekundärstrukturelementen wie α Helices charakterisiert werden. Zudem scheint das Protein unter stabilisierenden Bedingungen eine deutlich strukturiertere Konformation einzunehmen. Der Sirt1/AROS-Komplex musste zunächst durch Optimierung des Puffersystems stabilisiert werden. Anschließende Aktivitätstest von Sirt1 und AROS resultierten in einer Inhibition der Sirt1-Deacetylaseaktivität. Für die Isoformen 2,3 und 5 konnte ebenso eine AROS-vermittelte Inhibition gezeigt werden. Diese ist im Vergleich zu Sirt1 jedoch geringer. Als Interaktionsbereich im Sirtuin konnte der generische, katalytische Sirtuinkern identifiziert werden. Zudem lässt sich die höhere inhibitorische Wirkung von AROS auf Sirt1 durch zusätzliche Interaktionen mit der regulatorischen, N-terminalen Domäne von Sirt1 erklären. Für AROS konnte gezeigt werden, dass der mittlere Bereich des Proteins für die Inhibition verantwortlich ist. N- und C-terminale Abschnitte in AROS scheinen die Affinität zum Sirtuin durch zusätzliche Bindungsstellen zu erhöhen bzw. wichtige Bereiche für die Inhibition zu stabilisieren. Titrationen der beiden Sirt1-Substrate resultierten in einer Verringerung der Affinität des acetylierten Peptid-Substrates in Anwesenheit von AROS und liesen daher auf einen Inhibitons-Mechanismus, der auf Kompetiton mit dem acetylierten Peptid-Substrat beruht, schließen. Eine Kristallstruktur von Sirt3 konnte in Komplex mit einem AROS-Peptid gelöst werden. Im aktiven Zentrum des Sirtuins in der Bindungsstelle des acetylierten Lysins befindet sich das Lysin 65 von AROS, was den Kompetitionsmechanismus bestätigt. Unter Verwendung der strukturellen und mechanistischen Daten wurde ein Modell für den Sirt1/AROS-Komplex postuliert, in dem AROS die Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes durch Interaktion mit dem N-Terminus und der katalytischen Domäne von Sirt1 verhindert.

Abstract in weiterer Sprache

Sirtuins are an evolutionary conserved family of class III histone deacetylases. They catalyze the deacetylation of acyllysine residues substrate proteins by a unique mechanism that requires NAD+ as cosubstrate, which make sirtuins metabolic sensors. Moreover, they regulate stress responses and aging processes. As they are considered as targets in aging-related and metabolic diseases the regulation of sirtuins is of medical interest and has therapeutic potential. In this thesis, the endogenous regulation of sirtuins by the protein AROS and sirtuin modulation by small molecules were investigated. In contrast to Sirt6-specific activation, the plant flavonoid quercetin has an inhibitory effect on the other sirtuin isoforms. The molecular basis of the quercetin-mediated inhibition could be elucidated with the help of a crystal structure of the Sirt2/quercetin complex. Thus, the natural compound inhibits sirtuin activity by binding at the entrance of the active site resulting in competition with the acylated substrate. In Sirt6, this binding site is occupied by the N-terminus of the protein and is therefore not accessible. Instead Quercetin binds in a Sirt6-specific binding pocket. The Sirt2/quercetin structure helps to explain the Sirt6-specific activation effect of quercetin and thus provides information for further development of Sirt6-specific potent modulators. The findings of quercetin binding in Sirt2 could also contribute to the development of new quercetin-based inhibitors. In addition to the modulation of Sirt6 and Sirt2 the activation of Sirt3 is also in focus. As the only mitochondrial sirtuin with robust deacetylase activity it is considered as a promising target for pharmacological modulation by activators. Due to the lack of Sirt3 activators, new modulators for Sirt3 were screened by crystallography with a fragment library. As a result two new ligands and three unknown ligand-binding sites for Sirt3 were found. Based on these fragment scaffolds small molecules with potential to modulate Sirt3 activity could be developed. The protein AROS was initially described as the only endogenous activator of Sirt1 to date. Contrary to this other authors found an inhibitory effect of AROS on Sirt1 deacetylase activity. Understanding the regulatory mechanism of Sirt1 by AROS could contribute to the development of pharmacological modulators. In this work, the protein AROS was characterized for the first time. AROS accumulates in inclusion bodies in E. coli. Therefore, a renaturation protocol was established, resulting in soluble, pure protein. AROS could be characterized as a flexible protein without a stable tertiary structure but with secondary structural elements such as α-helices. In addition, the protein appears to adopt a much more structured conformation under stabilizing conditions. The Sirt1/AROS complex needed to be stabilized. This was done by optimizing the buffer system. Subsequent activity assays of Sirt1 and AROS resulted in an inhibition of Sirt1 deacetylase activity. For the isoforms 2,3 and 5, an AROS-mediated inhibition was shown, albeit with varying potency. The generic, catalytic sirtuin core was identified as the interaction region in the sirtuin. Furthermore, the higher inhibitory effect of AROS on Sirt1 can be explained by additional interactions with the regulatory N-terminal domain of Sirt1. For AROS, it was shown that the middle region of the protein is responsible for inhibition. N- and C-terminal extensions in AROS seem to increase the affinity to the sirtuin by additional binding sites or to stabilize important regions for inhibition. Titrations of the two Sirt1 substrates resulted in a decrease in the affinity of the acetylated peptide substrate in the presence of AROS, suggesting an inhibitory mechanism based on competition with the acetylated peptide substrate. A crystal structure of Sirt3 could be solved in complex with an AROS peptide. The active site of the sirtuin in the binding site of the acetylated lysine contains the lysine 65 of AROS, confirming the mechanism of competition. Using the structural and mechanistic data, a model for the Sirt1/AROS complex was postulated in which AROS prevents the formation of an enzyme-substrate complex by interacting with the N-terminus and catalytic domain of Sirt1.