The Switching Behaviour of Single Photochromic Triads studied with Fluorescence Microscopy

Titelangaben

Maier, Johannes:
The Switching Behaviour of Single Photochromic Triads studied with Fluorescence Microscopy.
Bayreuth , 2021 . - XV, 83 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Photochromism is the phenomenon that mocules can undergo reversible changes in their structure with light of a specific wavelength. Among a number of photochromic molecules, dithienylcyclopentene (DCP) is a molecular switch which undergoes a cyclization (ring-closing) reaction upon illumination with light in the ultraviolet (UV) spectral range. The cycloreversion (ring-opening) reaction is accomplished by illumination with light in the visible range. Such photochromic reactions can be useful for the application in two major fields. The first field is the application in molecular electronics, where their function as a switch can be exploited by designing transistors, gates, logic circuits, or even devices assembled thereof. The second big field of application is super-resolution microscopy. Special techniques are relying on the digital bright/dark- or on-/off-toggling of the fluorescence of single molecules in the sample in order to identify and localize single molecule fluorescence as single bright spots. Currently, most techniques rely on stochastic molecular processes causing intermittency in single molecule fluorescence. Photochromic switches with their ability to be deliberately switched feature a clear advantage. In this dissertation, photochromic triads consisting of one DCP and two covalently linked fluorophores, are examined. The triads are tailor-made macromolecules designed in such a way that the the state of the switch is monitored by the fluorescence of the fluorophores, which is quenched if the DCP is in its closed state due to an energy transfer from the fluorophores to the photochromic switch. Monitoring of the fluorescence means the use of confocal fluorescence microscopy in order to reveal the characteristics of the switching processes for ensembles and single triads. As tens or hundreds of thousand of photochromic triads are present in ensemble samples where the triads are immobilised in a polymer matrix, the fluorescence will decrease exponentially upon UV illumination, and increase with a saturated exponential growth when the UV illumination is ceased and only visible illumination excites the triads to fluorescence, each described by rate equations. This is in stark contrast for the switching of single triads, where a digital change between a highly fluorescent “On”-state and a weakly fluorescent “Off”-state is expected. A summary of those concepts is given, and additionally an experimental strategy for the switching of single photochromic triads is presented, where the focus lies on a slowed switching reaction. This is achieved making use of special triads and the conduction of experiments at low temperatures. The slowed reaction at low temperatures is of crucial interest for the experiments presented in two chapters, where the experimental focus lies on the detection of single molecule switching. In the first of these chapters, triads composed of a DCP switch and two strong perylene bisimide (PBI) fluorophores were used. The triads were immobilised in a polymer matrix and cooled down to 10K. The single triads are initialized in their closed, non-fluorescent state with UV illumination, which is then probed by visible illumination. As the triad will cycle excitation and radiationless decay in its closed form and then, after a statistically distributed time, undergo the cycloreversion reaction, the fluorescence will be delayed with respect to the onset of probe illumination. One measurement contained 400 switching cycles. However, also unavoidable stochastic blinking processes lead to a quenching of the fluorescence of the triads, and obscure the distribution of fluorescence delay times. This is why a control experiment of the same length was conducted and a statistical model of conditional probabilities was applied in order to distinguish between deliberate switching and stochastic blinking presenting the positive predictive value (PPV). It was found that on the average over 15 single triads, the PPV amounts to 0.8±0.1, the probability which can be assigned to deliberate switching rather than blinking for the triads measured. In the second chapter dealing with single molecule switching, the single molecule measurements were continued with the known triads with PBI moieties as fluorophores, and additionally triads that use boron dipyrromethene (BODIPY) as fluorophores were examined, and as many on-/off-cycles were probed as possible. As a result, the corresponding average PPV for 20 DCP-PBI and 18 DCP-BODIPY triads of 0.7±0.1 is - on the average - the same for both kinds of triads. Furthermore, this PPV was confirmed to be in the same range as for the one in the preceding chapter . In addition, the many repetitions of the measurement pairs switching experiment/control experiment lead to the conclusion that several thousands of switching cycles per triad are possible, showing a remarkably high fatigue resistance of the switching process.

Abstract in weiterer Sprache

Photochromie nennt sich der Effekt, wenn sich Moleküle abhängig von der Beleuchtung mit Licht bestimmter Wellenlängen reversiblen Strukturänderungen unterziehen. Innerhalb einer Reihe photochromer Moleküle ist Dithienylcyclopenten (DCP) ein molekularer Schalter, dessen photochrome Reaktion eine Zyklisierung (Ringschlussreaktion) bei Beleuchtung mit Licht aus dem ultravioletten (UV) Bereich des Spektrums ist. Die gegenläufige Zykloreversion (Ringöffnungsreaktion) wird mit Licht aus dem sichtbaren Bereich erreicht. Solche photochromen Reaktionen können nützlich für die Anwendung in zwei großen Feldern sein. Das erste Feld ist die Anwendung in der molekularen Elektronik, in der ihre Funktion als Schalter für das Design von Transistoren, Gattern, logischen Schaltungen oder sogar davon zusammengesetzte Apparaten ausgenutzt wird. Das zweite große Anwendungsfeld ist die super-auflösende Mikroskopie (engl. super-resolution microscopy) jenseits der Beugungsgrenze. Spezielle Techniken beruhen darauf, dass die Intensität der Fluoreszenz von Molekülen digital zwischen hell und dunkel beziehungsweise AN/AUS schwankt, um so einzelne Moleküle zu identifizieren und lokalisieren zu können. Aktuell beruhen die meisten dieser Techniken auf stochastischen molekularen Prozessen, die zu den vorübergehenden Dunkelzuständen in der Fluoreszenz einzelner Moleküle führen. Photochrome Schalter mit ihrer Möglichkeit, die Dunkelzustände gezielt herbeizuführen, zeigen hier einen klaren Vorteil. In der vorliegenden Arbeit werden photochrome Triaden, die aus einem DCP und zwei daran kovalent gebundenen Fluorophoren bestehen, untersucht. Die Triaden sind maßgeschneiderte Makromoleküle, die so synthetisiert sind, dass sich der Schaltzustand des DCP anhand der Fluoreszenz der Fluorophore ablesen lässt, was auf einen Energietransfer von den Fluorophoren zum photochromen Schalter zurückzuführen ist. Die Fluoreszenz wird unterdrückt, wenn sich das DCP in seinem geschlossenen Zustand befindet. Das Aufnehmen der Fluoreszenz geschieht dabei durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie, um die Eigenschaften des Schaltens von Ensembles und einzelner Triaden zu untersuchen. Dadurch, das Zehn- oder Hundertausende Triaden in einer Ensemble-Probe in einer Polymermatrix eingebettet sind, nimmt die Fluoreszenz durch das Schalten exponentiell ab, wenn diese mit UV-Licht beleuchtet wird. Umgekehrt kehrt die Fluoreszenz bei Beleuchtung mit sichtbarem Licht mit einem exponentiellen Anstieg zurück, der bei der Anfangsfluoreszenz sättigt. Diesen Zusammenhängen kann man Ratengleichungen zuschreiben und so die Ringschluss- beziehungsweise Ringöffnungsreaktion charakterisieren. In einem deutlichen Gegensatz dazu wird für das Schalten einzelner Triaden ein digitales Schalten zwischen einem “An”- und einem “Aus”-Zustand erwartet. Diese beiden Konzepte werden vorgestellt, genauso wie eine experimentelle Strategie für das Schalten einzelner photochromer Triaden. Hier liegt der Fokus auf einem verlangsamten Schaltvorgang, erreicht durch den Einsatz spezieller Triaden und das Durchführen der Experimente bei tiefen Temperaturen. Ein verlangsamter Schaltvorgang ist eine wichtige Grundlage für die Experimente, die in zwei Kapiteln vorgestellt werden, deren Schwerpunkt auf Messungen zum Schalten einzelner Triaden liegt. Im ersten dieser Kapitel wurden DCP-PBI-Triaden eingesetzt und in einer Polymermatrix eingebettet, die bis auf 10K abgekühlt wurde. Die einzelnen Triaden werden durch UV-Beleuchtung in ihrem geschlossenen Zustand initialisiert, und dieser Zustand durch Beleuchtung mit sichtbarem Licht untersucht. Da die Triade Zyklen aus Anregung und strahlungsloser Rückkehr in den Grundzustand durchläuft, wird sie nach einer statistisch verteilten Zeit die Ringöffnungsreaktion vollziehen, sichtbar an Hand eines verspäteten Einsetzens der Fluoreszenz relativ zur Beleuchtung mit sichtbarem Licht. Eine Messung bestand aus 400 Schaltzyklen. Jedoch führen auch unvermeidbare Blinking-Ereignisse zu einem Ausbleiben der Fluoreszenz, die die Verteilung der Einschaltzeiten verfälschen. Deswegen wurden auch Kontrollexperimente durchgeführt und ein statistisches Modell für bedingte Wahrscheinlichkeiten angewandt, um zwischen geziehltem Einschalten und stochastischem Blinking zu unterscheiden. Das Ergebnis dieses Modells ist der positive Vorhersagewert (engl. positive predictive value, PPV), der im Mittel für 15 Triaden bei 0.8±0.1 liegt. Dies ist die Wahrscheinlichkeit, die mit gezieltem Schalten statt Blinking für die vermessenen Triaden verknüpft werden kann. Im zweiten Kapitel mit Einzelmolekülmessungen wurden die Messungen an einzelnen Molekülen fortgeführt, diesmal mit den bekannten Triaden mit den PBI-Fluorophoren und zusätzlich mit Triaden, bei denen statt des PBI als Fluorophore Bor-Dipyrromethene (BODIPY) als Fluorophore kovalent gebunden wurden. Es wurden so viele AN-/AUS-Zyklen wie möglich aufgenommen und als Ergebnis für beide Arten von Triaden im Mittel ein PPV von 0,7±0,1 berechnet. Dabei wurden 20 DCP-PBI Triaden und 18 DCP-BODIPY Triaden untersucht. Die vielen Wiederholungen der Paare Schaltexperiment/Kontrollexperiment lassen den Schluss zu, dass sich einzelne Triaden mehrere tausend Male schalten lassen, eine bemerkenswert hohe Dauerfestigkeit. 3