The role of retinoic acid in the development of pelvic fins in Danio rerio

Titelangaben

Draut, Heidrun:
The role of retinoic acid in the development of pelvic fins in Danio rerio.
Bayreuth , 2021 . - 235 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

The molecular mechanisms that control the development of paired extremities are broadly conserved among vertebrate species. The paired fins of fish - pectoral and pelvic fins - are homologous to the fore- and hindlimbs of land vertebrates. Consequently, a fundamental knowledge about signalling processes in zebrafish paired fin development might help to understand limb patterning and congenital limb defects in humans. All-trans-retinoic acid (RA) is a key factor in many developmental processes including limb development. The current model for forelimb development was predominantly determined from studies in mice (Cunningham et al., 2013; Mic et al., 2002, 2004; Sandell et al., 2007; Zhao et al., 2009), chicken (Nishimoto et al., 2015) and zebrafish (Begemann et al., 2001; Gibert et al., 2006; Grandel & Brand, 2011; Grandel et al., 2002). It suggests an antagonism between RA and fibroblast growth factors (FGFs) along the anteroposterior axis, which mediates the correct positioning of the limb field and establishes a permissive environment for the induction of limb budding (Cunningham et al., 2013; Zhao et al., 2009). Moreover, RA cooperatively interacts with β-catenin signalling and Hox genes to control Tbx5 expression during forelimb development in chicks (Nishimoto et al., 2015). Examinations in zebrafish agree with the requirement of RA for pectoral fin induction (Gibert et al., 2006). For hindlimb development, however, the roles of RA are still controversial. The idea of a similar role for RA in fore- and hindlimb development (Nishimoto et al., 2015) contrasts with the opinion that RA is dispensable for hindlimb development (Zhao et al., 2009). In the zebrafish model, comparable studies investigating the role of RA on pelvic fin development are missing, which is why this thesis focused on this particular question. Gene expression analysis on zebrafish larvae revealed the presence of Rdh10a, Aldh1a2, Cyp26b1 and Cyp26c1 transcripts during the early stages of pelvic fin bud formation. The expression pattern of these genes, which are involved in RA synthesis and metabolism, indicated the establishment of an anteroposterior RA gradient in the early pelvic fin bud. Later, activity of RA signalling associated genes was detected along the forming fin rays. Based on heat-shock treatments of transgenic Hsp70l:Cyp26a1 zebrafish larvae, overexpression of Cyp26a1 and thus a reduction of the RA level was achieved during pelvic fin formation. From the obtained results an important role of RA in the development of pelvic fins during early stages of fin bud formation was concluded. A complete inhibition of the formation of endo- and exoskeletal pelvic fin structures could be achieved if the heat-shock treatment was started before the first signs of a morphological fin bud appeared. After the onset of fin bud formation, Cyp26a1 overexpression resulted in the reduction of the overall length of the pelvic girdle accompanied by the lack of diverse skeletal elements, mostly the posterior process and the radials. These results indicate a putative role of RA in the pelvic fin initiation process, which seems to occur during a limited time frame. Moreover, they suggest a role of RA in pelvic girdle patterning and chondrogenesis. Additionally, a participation in fin ray formation and growth is likely. However, since the entire organism is affected in these experiments, unspecific effects cannot be ruled out. Therefore, the main focus of this work was to establish the binary Gal4-UAS system with the aim to manipulate RA signalling in a spatially and temporally controlled manner. On the one hand, driver lines provide the expression of either a hormone- or light-inducible Gal4 variant under the control of tissue-specific enhancers. Here, three Gal4 variations - ERT2-Gal4-VP16, KalTA4-ERT2 and GAVPO (Akerberg et al., 2014; Distel et al., 2009; Gerety et al., 2013; Kajita et al., 2014; Wang et al., 2012) - were investigated and considered suitable for the use in zebrafish. Tissue-specifity was achieved by selecting enhancers of the genes Prrx1a, Prrx1b and Pitx1, which are active specifically in pectoral and/or pelvic fins (Chan et al., 2010; Hernández-Vega & Minguillón, 2011). On the other hand, effector lines express genes encoding either a dominant-negative retinoic acid receptor (dnRarα2a) (Stafford et al., 2006) or the RA metabolizing enzyme Cyp26a1 under the control of five repetitive (5x) or four non-repetitive (4xnr) upstream activating sequences (UAS) (Akitake et al., 2011; Goll et al., 2009). Driver and effector constructs are equipped with minimal Tol2 cis sequences mediating transgene integration into the genome by Tol2 transposase activity. Moreover, different marker genes facilitate the identification of single or multiple transgenic zebrafish. As a proof-of-principle, the activation of dnRarα2a expression in F3 embryos of 5xUAS:dnRarα2a-IRES-eGFP zebrafish by injection of KalTA4-ERT2-GI mRNA, followed by induction with 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT) was demonstrated. Altogether, the basis for a valuable genetic tool was created, that combines several advantages: a simple and practical application, a simplified screening process, the visualisation of transgene activity and the optimization for the zebrafish model organism.

Abstract in weiterer Sprache

Die molekularen Mechanismen, welche die Entwicklung von paarigen Extremitäten kontrollieren, sind unter Vertebraten weitreichend konserviert. Die paarigen Flossen von Fischen - die Brust- und Bauchflossen - sind homolog zu den vorderen und hinteren Extremitäten von Landwirbeltieren. Demnach kann ein fundiertes Wissen über die ablaufenden Signalwege während der Entwicklung paariger Flossen im Zebrabärbling möglicherweise Aufschluss geben über angeborene Defekte der Extremitäten beim Menschen. Das aktuelle Modell zur Entwicklung von Extremitäten basiert überwiegend auf Studien an Mäusen (Cunningham et al., 2013; Mic et al., 2002, 2004; Sandell et al., 2007; Zhao et al., 2009), Hühnern (Nishimoto et al., 2015) und Zebrabärblingen (Begemann et al., 2001; Gibert et al., 2006; Grandel & Brand, 2011; Grandel et al., 2002). Es beschreibt unter anderem einen Antagonismus zwischen Retinsäure und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren entlang der anteroposterioren Achse, welcher die Positionierung der Extremität festlegt und die Vorrausetzung für die Induktion der Extremitäten-Knospe schafft (Cunningham et al., 2013; Zhao et al., 2009). Zur Aktivierung der Tbx5-Expression in Hühnern, interagiert Retinsäure zudem in kooperativer Art und Weise mit Komponenten des β-Catenin Signalweges sowie mit Hox Genen (Nishimoto et al., 2015). Untersuchungen an Embryonen des Zebrabärblings deuten ebenfalls auf eine Funktion von Retinsäure bei der frühen Induktion der Brustflosse hin (Gibert et al., 2006). In Bezug auf die Entwicklung der hinteren Extremitäten sind die Funktionen von Retinsäure bisher noch widersprüchlich. Hierbei steht die Idee einer ähnlichen Rolle von Retinsäure in vorderen und hinteren Extremitäten (Nishimoto et al., 2015) der Meinung gegenüber, dass Retinsäure für die Entwicklung hinterer Gliedmaßen nicht notwendig ist (Zhao et al., 2009). Vergleichbare Studien im Zebrabärbling fehlen in diesem Zusammenhang noch, weshalb sich diese Arbeit auf die Aufklärung ebendieser Fragestellung fokussiert. Eine Analyse der Genexpression von Rdh10a, Aldh1a2, Cyp26b1 und Cyp26c1 an Larven des Zebrabärblings bestätigte die Aktivität dieser Gene, welche Teil der Retinsäure-Synthese sowie ihres Metabolismus sind, während der frühen Entwicklung der Bauchflosse. Ihr Expressionsmuster deutet auf die Bildung eines anteroposterioren Retinsäure-Gradienten in den frühen Stadien der Flossenknospe hin. Später wurde die Aktivität von Genen des Retinsäure-Signalweges entlang der sich bildenden Flossenstrahlen nachgewiesen. Ausgehend von Hitzebehandlungen transgener Hsp70l:Cyp26a1 Larven des Zebrabärblings wurde während der Bauchflossenentwicklung eine Überexpression von Cyp26a1 und damit eine Verringerung des Retinsäure-Pegels hervorgerufen. Aus den erhaltenen Ergebnissen wurde eine wichtige Rolle von Retinsäure während der Bauchflossenentwicklung abgeleitet. Die Bildung von Elementen des Endo- und Exo-Skelettes konnte bei Beginn der Hitzebehandlung vor dem Auftreten erster morphologischer Anzeichen einer Bauchflossenknospe vollständig unterdrückt werden. Nach dem Einsetzen der Flossenknospenbildung führte die Überexpression von Cyp26a1 zu einer Verringerung der Gesamtlänge des Beckengürtels sowie zum Verschwinden verschiedener Skelettelemente, wobei hier in erster Linie die posterioren Prozesse und die Radiale betroffen waren. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von Retinsäure beim Initiierungsprozess der Bauchflossen hin, welche scheinbar auf einen eng limitierten Zeitrahmen beschränkt ist. Weiterhin legen sie eine Rolle bei der Strukturierung des Beckengürtels sowie der Chondrogenese nahe. Eine Beteiligung von Retinsäure an der Formierung und dem Wachstum der Flossenstrahlen ist ebenfalls wahrscheinlich. Da diese Experimente aber den gesamten Organismus betreffen, können unspezifische Effekte nicht ausgeschlossen werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag daher auf der Etablierung des binären Gal4-UAS Systems mit dem Ziel, eine räumlich und zeitlich gesteuerte Manipulation des Retinsäure-Signalweges zu ermöglichen. Hierbei dienen die Treiber-Linien der Expression von hormon- oder light-induzierbaren Gal4-Varianten, welche unter der Kontrolle von gewebe-spezifischen regulatorischen Elementen erfolgt. In diesem Zusammenhang wurden drei verschiedene Gal4-Varianten - ERT2-Gal4-VP16, KalTA4-ERT2 und GAVPO (Akerberg et al., 2014; Distel et al., 2009; Gerety et al., 2013; Kajita et al., 2014; Wang et al., 2012) - getestet und für das Modellsystem Zebrabärbling als geeignet eingestuft. Die Gewebespezifität wurde durch die Wahl von regulatorischen Elementen der Gene Prrx1a, Prrx1b und Pitx1 ermöglicht, welche spezifisch in Brust- und/oder Bauchflossen aktiv sind (Chan et al., 2010; Hernández-Vega & Minguillón, 2011). Die Effektor-Linien sind für die Expression von Genen verantwortlich, welche den Retinsäure-Signalweg inhibieren. Diese kodieren entweder für eine dominant-negative Version des Retinsäure-Rezeptors Rarα2a (dnRarα2a) (Stafford et al., 2006) oder Cyp26a1. Ihre Expression wird durch fünf repetitive (5x) oder vier nicht-repetitive (4xnr) vorgeschaltete Aktivator-Sequenzen (UAS) gesteuert (Akitake et al., 2011; Goll et al., 2009). Treiber- und Effektor-Linien sind mit Tol2 cis Sequenzen ausgestattet, anhand derer aktive Tol2 Transposase die Integration des Transgens in das Genom ermöglicht. Zudem erleichtern verschiedene Marker-Gene die Identifizierung einfach oder mehrfach transgener Zebrabärblinge. Zur Bestätigung des Funktionsprinzip wurde die Aktivierung der dnRarα2a-Expression in F3-Embryonen der Linie 5xUAS:dnRarα2a-IRES-eGFP, nach Injektion von KalTA4-ERT2-GI-mRNA und anschließender Induktion mit 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT), demonstriert. Insgesamt wurde somit die Basis für ein wertvolles genetisches Werkzeug geschaffen, welches mehrere Vorteile ineinander vereint: eine einfache und praktische Anwendung, eine vereinfachte Identifizierung von transgenen Nachkommen, die Visualisierung der Transgenaktivität sowie die Optimierung für das Modellsystem Zebrabärbling.