Quantitative Aufklärung der Wechselwirkungen zwischen Phytochromen und Partnerproteinen

Titelangaben

Golonka, David:
Quantitative Aufklärung der Wechselwirkungen zwischen Phytochromen und Partnerproteinen.
Bayreuth , 2025 . - 225 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Wahrnehmung von Licht ist essenziell für viele Organismen, um sich an ihre Umgebung anzupassen. Zu diesen Zweck besitzen Lebewesen sensorische Photorezeptorproteine mit unterschiedlichster Lichtsensitivität. Photorezeptoren bestehen aus einem Sensormodul, das den Chromophor für die Lichtwahrnehmung enthält, und einem Effektormodul für die Vermittlung der biologischen Funktion. Aufgrund ihrer Sensitivität, der Reversibilität und der zeitlichen und räumlichen Präzision der kontrollierten Antworten sind sie daher ein gefragtes Werkzeug, um zelluläre Prozesse mit Hilfe von Licht zu steuern, eine als Optogenetik bezeichnete Technik. Phytochrome sind rot- und fernrotlichtabsorbierende Photorezeptoren deren Signalzustände bimodular gesteuert werden können. Die von ihnen detektierten Wellenlängen besitzen eine hohe Eindringtiefe in biologisches Gewebe und sind daher von hohem Interesse für die Optogenetik. In dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Aspekte von Phytochromsystemen untersucht, wobei ein Hauptaugenmerk auf lichtgesteuerte Protein-Protein Interaktion, die von pflanzlichen Phytochromen eingegangen werden, lag. Die Wechselwirkung zwischen dem Arabidopsis thaliana Phytochrom B (PhyB) und seinen Interaktionsfaktoren (PIFs) ist die bekannteste rot- bzw. fernrotlichtabhängige Protein-Protein Interaktion. Nach Rotlichtbestrahlung erfährt AtPhyB strukturelle Veränderungen auf molekularer Ebene, die die Wechselwirkung mit PIF Proteinen erlauben. Nach längerer Zeit im Dunkeln oder nach Fernrotlichtbestrahlung geht die Interaktion jedoch wieder verloren. Trotz ihrer vielfältigen Anwendung ist überraschenderweise relativ wenig über die Interaktion dieser Proteine bekannt. So konnte in der Vergangenheit zwar bereits gezeigt werden, dass lediglich das photosensorische Modul von AtPhyB und das APB (active phytochrome B binding) Motiv der PIFs für die Wechselwirkung benötigt werden, jedoch ist nicht viel über die Interaktionsstärke und Dynamik bekannt. Aus diesem Grund wurden verschiedene biophysikalische und fluoreszenzspektroskopische Verfahren etabliert und angewandt, um die Interaktion von natürlichen und modifizierten PIF Proteinen mit dem rotlicht- bzw. fernrotlichtadaptierten Zuständen von AtPhyB zu untersuchen. Die gewonnenen Erkenntnisse eröffnen neue Einblicke in das APB Motiv von PIFs, liefern Dissoziationskonstanten für die Interaktion von PIF Proteinen mit den beiden Zuständen von AtPhyB und zeigen auf, dass die Interaktionsstärke durch die Assoziationsreaktion definiert wird. A. thaliana besitzt noch weitere Phytochrome, jedoch ist zum aktuellen Zeitpunkt noch wenig über potenzielle Interaktionspartner bekannt. In einem kollaborativen Projekt wurde ein Protein, benannt als OPA, mit unbekannter biologischer Funktion identifiziert, das lichtabhängige Protein-Protein Interaktion mit Phytochrom A (PhyA) eingeht und keine Wechselwirkung mit AtPhyB zeigt. In dieser Arbeit wurde die lichtabhängige Interaktion von AtPhyA mit OPA bzw. einer verkürzten OPA Variante untersucht. Um die zuvor beschriebenen Wechselwirkungen ausüben zu können, verwenden pflanzliche Phytochrome den Chromophor Phytochromobilin, der nicht in anderen Organismen vorhanden ist. Für die Anwendung außerhalb von Pflanzen setzt dies die Versorgung mit geeigneten Chromophoren voraus, was die Einsatzmöglichkeiten reduziert. Es konnte hier gezeigt werden, dass im Gegensatz zu früheren Annahmen AtPhyB den Chromophoren Biliverdin, eine Vorstufe des Phytochromobilin, verwenden kann. Die lichtgesteuerte Protein-Protein Interaktion ist unabhängig vom eingebauten Chromophor. Aufgrund der spektralen Eigenschaften des AtPhyB mit Biliverdin wurde auf einen neuartigen Bindemechanismus für Biliverdin in pflanzlichen Phytochromen geschlossen. Basierend auf diesem Bindemechanismus ist eine modifizierte Biliverdin-bindende AtPhyB Variante erstellt worden, die einen erhöhten Einbaugrad mit Biliverdin zeigt. Die neue Variante könnte somit das Anwendungsmöglichkeiten von AtPhyB in anderen Organismen beflügeln. Neben den pflanzlichen Phytochromen wurde auch das bakterielle Phytochrom aus Deinococcus radiodurans (DrBphP) untersucht, das als Paradigma für die Strukturbiologie und Signalweiterleitung von Phytochromen fungiert. Bakterielle Phytochrome agieren in der Regel als Histidinkinasen, jedoch wurde für DrBphP nie eine solche Funktion festgestellt. In einem kollaborativen Projekt wurde dieses offenstehende Rätsel gelöst und gezeigt, dass DrBphP als rotlichtaktivierte Phosphatase agiert. Die innerhalb dieser Arbeit analysierte Interaktion von DrBphP mit seinem Antwortregulator unterstützt diese Entdeckung. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass diese Doktorarbeit neue Einblicke in Phytochrome und deren Interaktion mit Partnerproteinen gewährt. Die hierin erbrachten Erkenntnisse werden es ermöglichen die quantitative Untersuchung und Analyse der Signalweiterleitung in Pflanzen besser zu verstehen. Des Weiteren eröffnen sie die Möglichkeiten bereits bestehende lichtabhängige Interaktionssysteme zu optimieren und neue Einsatzgebiete für pflanzliche Phytochrome zu erschließen. Alternative lichtgesteuerte Interaktionssysteme und eine rotlichtaktivierbare Phosphatase stehen außerdem dazu bereit Einsatz in der Optogenetik und Biotechnologie zu finden.

Abstract in weiterer Sprache

The detection of light conditions is essential for many organisms, as it allows them to adapt to the environment. For this purpose, organisms possess sensory photoreceptors that respond to different light qualities. Photoreceptors consist of a sensor module, which contains the chromophore for light sensing, and an effector module, which mediates biological function. Owing to the sensitivity, reversibility and spatiotemporal precision of the responses controlled by photoreceptors, they are powerful tools for the control of cellular processes by light, an approach called optogenetics. As one photoreceptor class, phytochromes sense red to far-red light and can be bimodally toggled between two signaling states. Since light of these colors exhibits deep tissue penetration, phytochromes are of considerable interest for optogenetic application. This thesis studies different aspects of phytochrome systems, with the main focus on light-controlled protein-protein interaction of plant phytochromes. The interaction of the Arabidopsis thaliana phytochrome B (PhyB) and its interacting factors (PIFs) is arguably the most prominent red and far-red light-controlled protein-protein interaction. Upon red light illumination, AtPhyB undergoes conformational changes that allow interaction with PIFs. The interaction is lost, if the system is kept in dark for a prolonged time or illuminated with far-red light. Although widely used, only sparse and qualitative data are available on the molecular interaction of these proteins. Previous studies identified the photosensory core module of AtPhyB and the APB (active phytochrome B binding) motif of PIFs as sufficient for binding. However, quantitative information on interaction strength and dynamics is missing. To address this deficit, several biophysical and fluorescence-spectroscopic methods were established and applied to the interaction of natural and modified PIF proteins with AtPhyB under red and far-red light. The findings precisely delineate the APB motif, provide dissociation constants for the interaction, and reveal that the light dependence of the interaction is encoded in the association kinetics. A. thaliana also possesses several other phytochromes, but little is known about their potential interaction partners. Within a collaborative project, a protein of unknown biological function, denoted OPA, was found to undergo light-dependent interactions with phytochrome A (PhyA) but not with AtPhyB. In this thesis, the light-dependent interaction of AtPhyA with OPA and a shortened OPA variant is quantitatively analyzed. To mediate the above and related responses, plant phytochromes utilize the plant-specific chromophore phytochromobilin, which however is generally absent in other organisms. Therefore, deployment outside of plants mandates the supplementation of suitable chromophores, thus limiting the application scope. This work demonstrates that contrary to the prevalent view in the field, AtPhyB can utilize biliverdin, a precursor of the plant-specific chromophore. The light-controlled interaction with PIFs is independent of the incorporated chromophore. Based on spectral analysis, a novel mechanism for biliverdin binding in plant phytochromes was elucidated. On the grounds of this mechanism, a modified biliverdin-binding AtPhyB variant was designed which enhanced biliverdin incorporation and thereby, stands to spur the application of AtPhyB in other organisms. This thesis also deals with the bacterial phytochrome of Deinococcus radiodurans (DrBphP) that serves as a paradigm in structural biology and signal transduction. Bacterial phytochromes generally act as histidine kinases, but previously no catalytic activity was observed for DrBphP, although it exhibits pronounced structural responses to light. Within a collaborative project, this long-standing conundrum was resolved by revealing that DrBphP acts as red-light-activated phosphatase. The analysis of the interaction that DrBphP undergoes with its partner protein, achieved within this thesis, provide support for these findings. Taken together, this thesis provides unprecedented insight into phytochromes and the interactions they enter with partner proteins. These findings will facilitate the quantitative interrogation and analysis of signal transduction in plants. Moreover, they enable the construction of optimized, light-dependent interaction systems and thereby unlock additional applications for plant phytochromes. Alternative light-controlled interaction systems and a red-light-activated phosphatase stand ready for implementation in optogenetics and biotechnology.