Biochemical and structural characterization of the regulation of human Sirtuin 1 by small molecules and proteins

Titelangaben

Adolph, Ramona S.:
Biochemical and structural characterization of the regulation of human Sirtuin 1 by small molecules and proteins.
Bayreuth , 2023 . - XIV, 192 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Sirtuins are NAD+-dependent lysine deacylases, which regulate various cell signaling pathways and are associated with lifespan extension through caloric restriction. The human isoforms Sirt1-7 are linked to diverse age-related diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, but also cancer and AIDS. Sirtuins are therefore emerging targets for therapeutic approaches and regulating sirtuin activity contextually is important. While current pharmacological modulation of sirtuin activity is almost exclusively restricted to inhibitors, which often lack isoform-specificity, potency, or bioavailability, the physiological modulation of sirtuin activity by other proteins is incompletely understood. This study covers important and new aspects for the physiological and pharmacological regulation of human Sirtuin 1. Concerning regulation by small molecules, the activation of hSirt1 by dehydroabietic acid was characterized providing potential for pharmacological modulation with a new nature-derived activator scaffold. In addition, the proposed anti-tumor potential of tranilast was linked to inhibition of hSirt1. Regarding the physiological modulation of hSirt1 activity by other proteins, conflictive results were available for hAROS. Within this thesis, hAROS was validated as hSirt1 inhibitor. Furthermore, a stable core was suggested for the intrinsically disordered protein hAROS, which will be used for future interaction analyses. Conversely, an hSirt1-activity modulating effect for human Hic1 has not been described yet. Focusing on the interaction between hSirt1 and the BTB/POZ domain of Hic1, this study showed that the interaction is limited to the catalytic domain of hSirt1 and does not require phosphorylation of hSirt1, nor the presence of NAD+ or sirtuin substrate. Hic1-BTB might even have a dual and concentration-dependent effect on hSirt1 activity, which will be subject to future studies. In addition, the first crystal structure of Hic1 was solved demonstrating a typical BTB fold and offering an analysis of putative interacting regions with hSirt1. Finally, the region of hSirt1 interacting with HIV1-Tat was also identified as the catalytic domain and an additional in vitro inhibition of the structurally similar catalytic domains of hSirt2 and hSirt3 was observed. Tat binding to hSirt1-3 was competitive to the sirtuin substrate, but not to NAD+. In line with this observation, several complex structures of hSirt3 with Tat peptides could demonstrate that acetylated or deacetylated Tat binds to the sirtuin substrate binding cleft with its basic region. Using structural superpositions and crosslinking, the major contribution to binding was found to be mediated by HIV1-Tat amino acids 49-52, while Tat amino acids 53-59 provide the additional high potency needed for physiological inhibition of hSirt1 through disruption of an important salt bridge between the hSirt1 SBD and catalytic core.

Abstract in weiterer Sprache

Sirtuine sind NAD+-abhängige Lysin-Deacylasen, die diverse zelluläre Prozesse beeinflussen und mit den positiven Effekten der Kalorienlimitierung in Verbindung gebracht werden. Die humanen Isoformen Sirt1-7 sind überdies hinaus an diversen altersbedingten Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson, aber auch Krebs und AIDS beteiligt. Daher gewinnt die kontextabhängige Regulation von Sirtuinen zunehmend an Bedeutung für therapeutische Anwendungen. Bisher beschränkt sich die pharmakologische Modulation der Sirtuinaktivität nahezu ausschließlich auf Inhibitoren mit häufig unzureichender Spezifität, Wirkungskraft oder biologischer Verträglichkeit. Die physiologische Sirtuinregulation durch Proteine ist zudem unvollständig erfasst. Diese Studie umfasst nun neue Aspekte der physiologischen und pharmakologischen Regulation von humanem Sirtuin 1. Im Bereich der Kleinmolekülregulation konnte die Aktivierung von hSirt1 durch Dehydroabietinsäure charakterisiert werden, sodass ein neues, naturnahes Aktivatorgerüst zur Modulation der Spezifität zur Verfügung steht. Weiterhin wurde die tumorhemmende Wirkung von Tranilast auf eine Inhibition von hSirt1 zurückgeführt. Bezüglich der physiologischen Regulation von hSirt1 durch andere Proteine wurden bisher widersprüchliche Ergebnisse zu hAROS veröffentlicht. In dieser Studie konnte nun eine inhibierende Wirkung bestätigt werden. Zudem scheint das intrinsisch ungeordnete Protein hAROS einen stabilen Kern zu besitzen, welcher für zukünftige Interaktionsstudien mit hSirt1 genutzt werden kann. Dagegen wurde bisher noch kein modulierender Effekt der hSirt1-Aktivität durch humanes Hic1 beschrieben. Hier konnte gezeigt werden, dass für die Interaktion der BTB/POZ-Domäne von Hic1 mit hSirt1 nur die katalytische Domäne von hSirt1 benötigt wird und keine Phosphorylierung von hSirt1 oder die Anwesenheit von NAD+ oder Substrat erfordert. Hic1-BTB könnte sogar einen dualen und konzentrationsabhängigen Effekt auf die hSirt1-Aktivität haben, was Gegenstand zukünftiger Studien sein wird. Weiterhin wurde die erste Kristallstruktur von Hic1 gelöst, welche eine typische BTB-Faltung zeigt und zur Analyse möglicher Interaktionsbereiche dient. Schließlich konnte auch die mit HIV1-Tat interagierende Region von hSirt1 auf die katalytische Domäne beschränkt werden, wobei eine zusätzliche in vitro-Inhibition der strukturell ähnlichen katalytischen Domänen von hSirt2 und hSirt3 beobachtet wurde. Die Bindung von Tat an hSirt1-3 war kompetitiv zum Substrat, aber nicht zu NAD+, was durch mehrere Komplexstrukturen von hSirt3 mit Tat-Peptiden bestätigt wurde. Durch Strukturüberlagerungen und Quervernetzung konnte gezeigt werden, dass acetyliertes oder deacetyliertes Tat mittels der Aminosäuren 49-52 seiner basischen Region in die Sirtuin-Substratbindetasche bindet. Die zusätzliche hohe Wirksamkeit der physiologisch bedeutenden hSirt1-Inhibition wird dabei durch die Aminosäuren 53-59 von Tat vermittelt, welche eine wichtige Salzbrücke zwischen der Sirt1 SBD und der katalischen Domäne aufbrechen.