Design neuer rotlichtaktivierter Enzyme zur Kontrolle von zyklischen Mononukleotiden

Titelangaben

Stabel, Robert:
Design neuer rotlichtaktivierter Enzyme zur Kontrolle von zyklischen Mononukleotiden.
Bayreuth , 2020 . - V, 132 S.
( Dissertation, 2019 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Sensory photoreceptor proteins mediate diverse light responses across organisms from all domains of life. Like other signal receptors, they feature modular architecture and comprise photosensor and effectors. The sensor module incorporates a chromophore to absorb light of distinct wavelength; conformational signals are then propagated via a linker to the effector to trigger a specific biological response. The modular composition enables the engineering of novel photoreceptors via rewiring of the sensor and effector modules. A particular challenge lies in the coupling of the modules such that productive signal propagation is maintained. Photoreceptors underpin the field of optogenetics where they enable the minimally invasive control of diverse processes in cells and organisms with high spatiotemporal resolution and exquisite molecular specificity. This thesis covers the engineering of synthetic photoreceptors for optogenetic deployment. To systematically probe the linker between sensor and effector modules, the PATCHY method is applied to two derivatives of the histidine kinase YF1. In the original lightrepressed YF1, linker lengths of 7n (n = 1, 2, 3, ...) and 7×n+1 are associated with lightrepressed and light-activated responses, respectively. For the two YF1 variants, lightregulated activity is also concentrated in discrete length registers, albeit with inverted signal response and to lesser extent. Linker length evidently governs output activity of the receptor and hence provides an efficient means for its rational modification. The main chapters of the thesis focus on the engineering of novel photoreceptors for the optogenetic control of cyclic mononucleotide metabolism. In the cell, phosphodiesterases (PDE) and nucleotidyl cyclases (ACs or GCs) control the level of cyclic mononucleotides which serve as second messengers in many important responses in eukaryotes and prokaryotes alike. This thesis expands the range of optogenetic tools by novel red/far-red- (R/FR) light-regulated cyclases and phosphodiesterases, thus allowing to study cellular metabolism with enhanced control. To this end, the light-inert sensor module of a cyclase is exchanged for different R/FR-switchable bacteriophytochrome (BphP) sensor modules to create novel photoactivated adenylyl cyclases (PACs). A fluorescence-based reporter assay enables the characterization and optimization of the PACs. The variant DdPAC, based on the Deinococcus desertii BphP, shows a 9.8 fold activity increase under red light and complete shutting off via far-red light. Likewise, the light-activated PDE LAPD is improved in terms of hydrolysis activity, regulatory efficiency and basal activity. To this end, the BphP and the PDE modules of LAPD are substituted for homologues photosensor and effectors. The variant Dr-BtPDE2A, based on the Deinococcus radiodurans BphP and the Bos taurus PDE2A, exhibits the best performance with an 8-fold increased activity upon red light and an improved off-switching upon far red-light illumination. For use in optogenetics, LAPD variants can be used alone or in tandem with PACs to manipulate cyclic mononucleotides levels and downstream processes in living cells like the gating of certain ion channels. The new PAC and LAPD variants, generated throughout this thesis, generally inform the engineering of synthetic R/FR-sensitive photoreceptors. Intermolecular interactions between sensor and effector modules play important functional roles but also complicate receptor engineering. This work identifies the homologous exchange of sensor and effector modules as a valid strategy for the creation of novel R/FR-sensitive photoreceptors.

Abstract in weiterer Sprache

Sensorische Photorezeptor-Proteine vermitteln, in Abhängigkeit von Licht, vielfältige organismische Anpassungen in allen Reichen des Lebens. Wie auch andere Signalproteine weisen sie einen modularen Aufbau auf und bestehen aus einem (Photo-) Sensor- und einem Effektor-Modul. Das Sensor-Modul detektiert mit Hilfe eines Chromophors Licht und leitet das Signal über ein Verbindungsstück, der Linker, in das Effektor-Modul weiter, welches eine spezifische biologische Aktivität vermittelt. Der modulare Aufbau ermöglicht die Rekombination des Sensor-Moduls mit einem Effektor-Modul einer anderen Aktivität. Die Herausforderung ist hierbei, die Signalweiterleitung zwischen Sensor- und Effektor-Modul aufrechtzuerhalten. In der Optogenetik werden Photorezeptoren zur minimalinvasiven Kontrolle diverser Prozesse in Zellen und Lebewesen durch Licht, eingesetzt. Der größte Vorteil der Optogenetik ist die hohe räumliche und zeitliche Auflösung und die molekulare Spezifität der Methode. In dieser Arbeit werden verschiedene Aspekte für das Design von synthetischen Photorezeptoren behandelt. Zum einen wird auf die Rolle des verknüpfenden Linker zwischen Sensor und Effektor-Domäne eingegangen, und zum anderen werden neue Hybridproteine als Werkzeug für die optogenetische Kontrolle der Bildung und des Abbaus zyklischer Mononukleotide erschaffen. Mit Hilfe der PATCHY-Methode wurde der Einfluss des Linkers auf die Aktivität von lichtaktivierten Varianten D21V und H22P der Histidinkinase YF1 untersucht. In YF1 zeigen Varianten mit einer Linkerlänge von 7n Aminosäuren lichtreprimiertes und Varianten mit einer Länge von 7n+1 lichtaktiviertes Verhalten. Für die Varianten D21V und H22P wurden lichtregulierte Konstrukte ebenfalls nur in bestimmten Registern gefunden, allerdings mit sehr schwach ausgeprägter Periodizität. Dennoch wurden wichtige Erkenntnisse bezüglich der Abhängigkeit der Aktivität von der Linkerlänge gewonnen. Zyklische Mononukleotide spielen eine wichtige Rolle als Botenstoffe in der Signaltransduktion von Eu- und Prokaryonten. In Zellen erfolgt die Regulation zyklischer Mononukleotide durch Phosphodiesterasen (PDEs) und Zyklasen. Im Bereich der Optogenetik finden bereits photoaktivierbare Adenylylzyklasen (PACs) und die rotlichtaktivierte Phosphodiesterase (LAPD) Anwendung. Die in dieser Arbeit vorgenommene Erschaffung neuer Rot/Fernrot- (R/FR) schaltbarer Zyklasen und Phosphodiesterasen erweitert die Palette der optogenetischen Werkzeuge und ermöglicht so die Adressierung neuer Fragestellungen. Dazu werden, neben anderen Photosensoren, die(R/FR)-schaltbaren Bakteriophytochrome (BphP) für die Erschaffung von synthetischen Photorezeptoren genutzt. Für die Erzeugung R/FR schaltbarer Zyklasen wurden das Sensor-Modul einer Zyklase durch verschiedene Bakteriophytochrom Sensor-Module ersetzt. Mittels eines fluoreszenzbasierten Testsystems konnten die verschiedenen Varianten hinsichtlich ihrer Lichtschaltbarkeit charakterisiert werden. Das beste Konstrukt auf Basis des Deinococcus dersertii BphP (DdPAC) zeigte eine 9,8-fache Aktivierung mittels Rotlichtbeleuchtung, die mittels Fernrotlicht aufgehoben werden konnte. LAPD wurde hinsichtlich ihrer Hydrolyseaktivität, Lichtschaltbarkeit und Dunkelaktivität verbessert. Dazu wurde zum einen das Sensor-Modul, das BphP aus Deinococcus radiodurans, gegen homologe Bakteriophytochrome und zum anderen das Effektor-Modul gegen homologe PDEs ausgetauscht. Von den erzeugten LAPD Varianten zeigte die sogenannte Dr-BtPDE2A, auf Basis der Bos taurus PDE2A, eine ~8fach höhere Rotlichtaktivität und ebenfalls eine verbesserte Reversibilität der Schaltung. Für die optogenetische Anwendungen können die Konstrukte alleine oder als Antagonisten zu PACs verwendet werden, um die Konzentration von zyklischen Mononukleotiden zu steuern. Erste Versuche in HEK-Zellen zeigten bereits die lichtregulierte Steuerung eines CNG-Kanals mittels LAPD Varianten. Sowohl die erzeugten PACs, als auch die erzeugten LAPD Varianten, erbringen Einblicke in die Erschaffung synthetischer R/FR-Photorezeptoren. So spielen die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den Sensor- und Effektor-Modulen eine wichtige Rolle und können den Austausch dieser Module verkomplizieren. Der homologe Austausch des Sensor- oder Effektor-Moduls, erweist sich als probate Strategie für die Erzeugung neuer R/FR-Photorezeptoren.