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On piRNAs and PIWI proteins in Schmidtea mediterranea and their role in mRNA surveillance of adult stem cells

DOI zum Zitieren der Version auf EPub Bayreuth: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00004631
URN zum Zitieren der Version auf EPub Bayreuth: urn:nbn:de:bvb:703-epub-4631-6

Titelangaben

Kim, Iana:
On piRNAs and PIWI proteins in Schmidtea mediterranea and their role in mRNA surveillance of adult stem cells.
Bayreuth , 2020 . - xxviii, 149 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

Abstract

PIWI-Proteine nutzen kleine RNAs, sogenannte piRNAs, um Transposons abzubauen und damit die Integrität des Genoms der tierischen Keimbahn zu schützen. In dem zu den Planarien zugehörenden Plattwurm Schmidtea mediterranea sind PIWI-Proteine für dessen faszinierende Regenerationsfähigkeit und das Überleben der Tiere unerlässlich. Die Regenerationsfähigkeit von S. mediterranea beruht dabei auf adulten Stammzellen, sogenannten Neoblasten. In Neoblasten werden drei SMEDWI-Proteine exprimiert, wobei nur zwei - SMEDWI-2 und -3 – essentiell für die Tiere und deren Regeneration sind. Diese Studie konzentriert sich auf die Charakterisierung des piRNA-Weges in Planarien und auf das Verständnis der wesentlichen Funktionen von piRNAs in der Biologie der Neoblasten. Um einen Einblick in die piRNA-Maschinerie zu erhalten, wurde eine Kombination aus Immunfärbungen und der Sequenzierung immunpräzipitierter piRNAs verwendet. Die gewonnenen Daten zeigen, dass piRNAs im Genom von Planarien hauptsächlich in einzelsträngigen Clustern kodiert werden. Des Weiteren entdeckten wir zwei funktionell unterschiedliche Klassen von piRNAs in Planarien: piRNAs, die Sequenzen von Transposons (TE) aufweisen sowie solche, die aus Sequenzen protein-kodierender Gene bestehen. TE-basierte piRNAs werden während des post-transkriptionellen Abbaus von TE-Transkripten in einem heterotypischen Ping-Pong-Zyklus produziert, der überwiegend mithilfe von SMEDWI-2 und SMEDWI-3 betrieben wird. Von Genen abstammende piRNAs hingegen werden in einem homotypischen Ping-Pong-Zyklus von SMEDWI-3 hergestellt. Weitere Untersuchungen an SMEDWI-3-interagierenden Transkripten unter Verwendung einer Kombination aus RNA-Seq, HITS-CLIP, CLASH-Seq und Degradome-Seq zeigten die Beteiligung der piRNA-Maschinerie am mRNA-Umsatz in Neoblasten. Unsere Ergebnisse zeigen insbesondere, dass eine Klasse von mRNAs im homotypischen Ping-Pong-Zyklus durch SMEDWI-3 abgebaut wird, während eine andere Klasse von Transkripten eine SMEDWI-3-vermittelte endonukleolytische Spaltung und Prozessierung in piRNAs vermeidet. Die zwei von uns entdeckten Modi der Aktivität von SMEDWI-3 werden durch das Ausmaß an Komplementarität zwischen Ziel-Transkript und PIWI-geladener piRNA reguliert. Im Falle einer nicht perfekten Komplementarität der piRNA zur Ziel-mRNA, insbesondere in der Region nahe der nukleolytischen Spaltstelle (zwischen Nukleotid 10 und 11), ist der Abbau der erkannten mRNA durch SMEDWI-3 nicht möglich. Im Falle nahezu perfekter Komplementarität von piRNA und mRNA wird die Ziel-mRNA gespalten. Die weitere Analyse von mRNAs, die durch piRNAs abgebaut werden, zeigten das Vorhandensein eines aktiven piRNA-Pfades in epidermalen Zellen, in denen diese Transkripte wahrscheinlich als piRNAs-Vorläufer verwendet werden. Insgesamt charakterisiert die vorliegende Arbeit den piRNA-Weg in Neoblasten von S. mediterranea. Darüber hinaus entdeckt diese Arbeit einen somatische piRNA-Weg in epidermalen Zellen, der nur unter Verwendung von SMEDWI-2 abläuft. Sie schlägt zudem einen piRNA-Weg in neuronalen Zellen vor, in denen wir zwei SMEDWI-Proteine - SMEDWI-2 und -3 - entdeckten. Der piRNA-Weg in Planarien ist funktionell auf die Stilllegung von Transposons ausgerichtet, beteiligt sich jedoch auch am Abbau bestimmter mRNAs in Neoblasten. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit zahlreiche biochemische und Hochdurchsatz-Techniken für deren Einsatz in Planarien angepasst. Insgesamt stellt diese Studie deshalb eine enorme Erweiterung unserer Kenntnisse über die Rolle von PIWI-Proteinen und piRNAs bei der Regeneration von Süßwasser-Planarien der Spezies Schmidtea mediterranea dar.

Abstract in weiterer Sprache

PIWI proteins utilize small RNAs, called piRNAs, to silence transposable elements, thereby protecting the integrity of animal germline genome. In the planarian flatworm Schmidtea mediterranea, piRNAs and PIWI proteins are enriched in adult stem cells, called neoblasts. Neoblasts give rise to all planarian cell types ensuring tissue turnover and animal regeneration. The knockdown of two planarian PIWI proteins - SMEDWI-2 and SMEDWI-3 - impairs neoblasts development and deprives planarians of their ability to regenerate, resulting in a lethal phenotype. This study is focused on the characterization of the planarian piRNA pathway and on understanding the essential functions of piRNAs in neoblast biology. To gain insights into the planarian piRNA machinery, a combination of immunostaining and small RNA sequencing of immunoprecipitated piRNAs was used. We discovered two functionally distinct classes of piRNAs in planarians: piRNAs that map to transposable elements (TE) and those that map to coding genes. TE-derived piRNAs are produced during the post-transcriptional degradation of TE transcripts in a heterotypic ping-pong cycle, which is predominantly constituted by SMEDWI-2 and SMEDWI-3. Genic piRNAs, on the other hand, originate from the homotypic ping-pong cleavage of coding transcripts by SMEDWI-3 only. The guide piRNAs that direct the degradation of both transposable elements and protein-coding mRNAs are encoded in uni-strand genomic clusters. Further exploration of SMEDWI-3-targeted transcripts using combination of RNA-Seq, HITS-CLIP, CLASH and Degradome-Seq revealed the engagement of the piRNA pathway in mRNA surveillance in neoblasts. In particular, we find that one class of mRNAs is degraded in homotypic ping-pong cycle by SMEDWI-3, while another class of targeted transcripts evades SMEDWI-3-mediated endonucleolytic cleavage and processing into piRNAs. The two distinct modes of SMEDWI-3 activity are dictated by the degree of complementarity between a SMEDWI-3-bound guide piRNA and its target mRNA. In case guide piRNAs bind their targets with non-perfect complementarity, especially in the vicinity to the scissile phosphate bond between nucleotides 10 and 11, the degradation of the mRNA transcript by SMEDWI-3 is precluded. Otherwise, perfect or near-perfect base-pairing of guide piRNA to its target triggers the endonucleolytic cleavage of the targeted mRNA and the production of genic piRNAs. Further analysis of planarian mRNAs degraded in the piRNA pathway revealed the presence of an active piRNA pathway in epidermal cells, in which these transcripts are likely used as piRNAs precursors. Taken together, our data demonstrate that a piRNA pathway comprising three PIWI proteins (SMEDWI-1, -2, and -3) operates in neoblasts of S. mediterranea. However, only two PIWI proteins - SMEDWI-2 and -3 - are essential for regeneration and tissue homeostasis. Moreover, we find a somatic piRNA pathway that acts in epidermal cells with the use of SMEDWI-2 only. Another somatic pathway may also operate in neuronal cells, where we observed two SMEDWI proteins - SMEDWI-2 and -3. Functionally, the planarian piRNA pathway is responsible for silencing of transposable elements, which is the primary function of piRNA pathway in most animal. In addition, planarians have recruited piRNAs for mRNA surveillance - at least in neoblasts. Overall, this study sets the stage for studying the role of PIWI proteins and piRNAs in the planarian flatworm Schmidtea mediterranea. Moreover, it will serve as a catalyst for the use of numerous biochemical and sequencing techniques in planarians that were established during the course of this thesis.

Weitere Angaben

Publikationsform: Dissertation (Ohne Angabe)
Keywords: piRNAs; PIWI proteins; planarian flatworms; Schmidtea mediterranea; stem cells; neoblasts
Themengebiete aus DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften; Biologie
Institutionen der Universität: Graduierteneinrichtungen > Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT
Graduierteneinrichtungen > Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT > Molekulare Biowissenschaften
Graduierteneinrichtungen > Elitenetzwerk Bayern
Graduierteneinrichtungen > Elitenetzwerk Bayern > Structural Basis of Gene Regulation by Non-coding RNA
Graduierteneinrichtungen
Sprache: Englisch
Titel an der UBT entstanden: Ja
URN: urn:nbn:de:bvb:703-epub-4631-6
Eingestellt am: 14 Mai 2020 05:41
Letzte Änderung: 14 Mai 2020 05:41
URI: https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/4631

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