Systematische Studie der Transfektion von Säugerzellen mittels PDMAEMA-basierter paramagnetischer Nanosterne

Titelangaben

Stahlschmidt, Ullrich:
Systematische Studie der Transfektion von Säugerzellen mittels PDMAEMA-basierter paramagnetischer Nanosterne.
Bayreuth , 2019 . - 160 S.
( Dissertation, 2019 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Der Transfer genetischen Materials in Säugerzellen („Transfektion“) ist von großer Bedeutung für die Erzeugung genetisch modifizierter Zellen und kann heute mit verschiedenen Techniken bewerkstelligt werden. Bei der nicht-viralen Transfektion werden synthetische Vektoren (z.B. polykationische Polymere) eingesetzt, um das genetische Material (z.B. Plasmid-DNA) zu binden und in Form von sogenannten Polyplexen in die Zelle zu schleusen. Über die Mechanismen der Aufnahme der Polyplexe und die Freisetzung der DNA im Zellinneren ist jedoch bislang nur wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige sternförmige Nanopartikel vorgestellt, die sich zur Transfektion von Säugerzellen eignen. Diese "Nanosterne" bestehen aus einem festen γ-Fe2O3-Kern, der mit einer Silica-Hülle beschichtet und via Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) mit Poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylat (PDMAEMA) funktionalisiert wurde. Durch den Eisenoxid-Kern sind die Nanosterne paramagnetisch. Eine Bibliothek dieser Nanosterne, bei der sich die einzelnen Varianten hauptsächlich in Anzahl und Länge der PDMAEMA-Arme unterscheiden, wurde mit verschiedenen physikochemischen Methoden charakterisiert und die Transfektion von verschiedenen Säugerzellen untersucht. Die gebildeten Polyplexe aus Nanosternen und pDNA wurden auf ihre Größe und Oberflächenladung über Bestimmung des Zetapotenials und dynamischer Lichtstreuung (DLS) charakterisiert. Die Ladung der Polyplexe korrelierte mit dem N/P Verhältnis (Molverhältnis der Polymer-Aminogruppen zu den Phosphatgruppen der DNA) und erreichte je nach Nanostern ab einem N/P-Verhältnis ≥ 15 einen Sättigungswert von 15 bis 22 mV. Auch die Größe der Polyplexe zeigte eine Abhängigkeit vom N/P-Verhältnis, wobei eine Erhöhung von letzterem bis zu einer Sättigungsgrenze zu einer Verkleinerung der hydrodynamischen Radien führte. Eine Ausnahme bildeten die Nanosterne mit der kleinsten Armdichte, bei denen Aggregationsbildung beobachtet wurde. Der Grund liegt vermutlich in der geringeren elektrostatischen und sterischen Abstoßung der Nanosterne. Die Stabilität der Polyplexe wurde mit dem ΔT-Assay untersucht. Dabei zeigten Polyplexe in HBG Lösung mit steigenden N/P-Verhältnis eine höhere Stabilität als in NaCl-Lösung (150 mM). Als Ursache könnte ein pH-Effekt, der zu einer Veränderung der Ladungsdichte führt, in Betracht kommen. Diese Hypothese wurde durch zusätzliche pH-Messungen bestärkt. Für die Transfektionsstudien wurden Polyplexe aus verschiedenen Varianten der Nanostern-Bibliothek und einem Plasmid, welches für das grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert, gebildet und verschiedene Zelllinien transfiziert (CHO-K1, HEK-293, L929, Jurkat). Transfektionseffizienz und Zytotoxizität korrelierten mit dem N/P Verhältnis und der Architektur der Nanosterne, wobei die Vertreter mit einer Armdichte von ~ 0,06 Ketten/nm² die besten Transfektionsergebnisse zeigten. Des Weiteren wurde der zelluläre Magnetismus untersucht: Mit Nanosternen assoziierte Zellen zeigten magnetische Eigenschaften und konnten durch das Anbringen eines Magnetfeldes von den übrigen Zellen abgetrennt werden. Dabei wurde kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Zahl an magnetischen Zellen und der Transfektionseffizienz beobachtet. Auffällig war dabei der hohe Anteil magnetischer Zellen bei der Transfektion mit Nanosternen mit einer geringen Armdichte. Modifizierung der PDMAEMA-Arme mit zusätzlichen äußeren PDEGMA-Blöcken führte in Transfektionsexperimenten zu einer verbesserte Serumkompatibilität gegenüber den unmodifizierten Varianten. Im letzten Teil der Arbeit wurden CHO-K1 Zellen mit verschiedenen Vertretern der Nanostern-Bibliothek transfiziert und in Abhängigkeit von der Kinetik der Interaktion zwischen Zelle und Nanostern für die Dokumentation per TEM (Transmissionselektronenmikroskopie) präpariert und chemisch fixiert. Dabei konnten für alle untersuchten Nanostern-Varianten intrazelluläre Aggregationen auf den TEM-Aufnahmen lokalisiert werden. Auffällig war dabei die Co-Lokalisation mit multivesikulären Strukturen (MVBs; „multivesicular bodies“), bei denen es sich vermutlich um späte Endosomen oder Heterolysosomen handelte. Es wurden keine freien Nanopartikel im Zytoplasma oder im Zellkern gefunden. Darüber hinaus wurde demonstriert, wie die Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS) die Unterscheidung von Nanopartikeln und kontrastiertem biologischem Material ermöglicht. Ausnahme bildeten die Nanosterne mit der kleinsten Armdichte, bei denen Aggregationsbildung beobachtet wurde. Der Grund liegt vermutlich in der geringeren elektrostatischen und sterischen Abstoßung der Nanosterne. Die Stabilität der Polyplexe wurde mit dem ΔT-Assay untersucht. Dabei zeigten Polyplexe in HBG-Lösung mit steigenden N/P-Verhältnis eine höhere Stabilität als in NaCl-Lösung (150 mM). Als Ursache könnte ein pH-Effekt, der zu einer Veränderung der Ladungsdichte führt, in Betracht kommen. Diese Hypothese wurde durch zusätzliche pH-Messungen bestärkt. Für die Transfektionsstudien wurden Polyplexe aus verschiedenen Varianten der Nanostern-Bibliothek und einem Plasmid, welches für das grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert, gebildet und verschiedene Zelllinien transfiziert (CHO-K1, HEK-293, L929, Jurkat). Transfektionseffizienz und Zytotoxizität korrelierten mit dem N/P Verhältnis und der Architektur der Nanosterne, wobei die Vertreter mit einer Armdichte von ~ 0,06 Ketten/nm² die besten Transfektionsergebnisse zeigten. Des Weiteren wurde der zelluläre Magnetismus untersucht: Mit Nanosternen assoziierte Zellen zeigten magnetische Eigenschaften und konnten durch das Anbringen eines Magnetfeldes von den übrigen Zellen abgetrennt werden. Dabei wurde kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Zahl an magnetischen Zellen und der Transfektionseffizienz beobachtet. Auffällig war dabei der hohe Anteil magnetischer Zellen bei der Transfektion mit Nanosternen mit einer geringen Armdichte. Modifizierung der PDMAEMA-Arme mit zusätzlichen äußeren PDEGMA-Blöcken führte in Transfektionsexperimenten zu einer verbesserte Serumkompatibilität gegenüber den unmodifizierten Varianten. Im letzten Teil der Arbeit wurden CHO-K1 Zellen mit verschiedenen Vertretern der Nanostern-Bibliothek transfiziert und in Abhängigkeit von der Kinetik der Interaktion zwischen Zelle und Nanostern für die Dokumentation per TEM (Transmissionselektronenmikroskopie) präpariert und chemisch fixiert. Dabei konnten für alle untersuchten Nanostern-Varianten intrazelluläre Aggregationen auf den TEM-Aufnahmen lokalisiert werden. Auffällig war dabei die Co-Lokalisation mit multivesikulären Strukturen (MVBs; „multivesicular bodies“), bei denen es sich vermutlich um späte Endosomen oder Heterolysosomen handelte. Es wurden keine freien Nanopartikel im Zytoplasma oder im Zellkern gefunden. Darüber hinaus wurde demonstriert, wie die Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS) die Unterscheidung von Nanopartikeln und kontrastiertem biologischem Material ermöglicht.

Abstract in weiterer Sprache

The transfer of genetic material into mammalian cells ('transfection') is a vital tool for the generation of genetically modified cells. Nowadays, a variety of techniques exist to achieve the latter. Non-viral transfection involves the utilization of synthetic vectors, e.g. polycationic polymers, to condense the genetic material (e.g. plasmid DNA) via electrostatic interaction into complexes, referred to as 'polyplexes'. After particle formation, the polyplexes can enter the cells via endocytosis. However, the mechanisms of cellular uptake and intracellular release of the DNA are poorly understood so far. The scope of this work focused on novel star-shaped nanoparticles, referred to as 'nanostars', which are suitable for non-viral transfection of mammalian cells. The structure consists of a solid paramagnetic silica-coated γ-Fe2O3 core, which has been functionalized with Poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate (PDMAEMA) via atom transfer radical polymerization (ATRP). A library of highly homogeneous, paramagnetic nano-star polycations with varied arm lengths and grafting densities was characterized using different physico-chemical techniques and was used to conduct transfection studies in several mammalian cell lines. Size and surface charge of polyplexes formed with nanostars and pDNA were determined by measurement of the zeta potential and dynamic light scattering (DLS), indicating a correlation of polyplex charge with the N/P ratio (polymer nitrogen/DNA phosphorus). For N/P ratios ≥ 15, the polyplex charge reached a plateau of 15 – 22 mV. Polyplex size measurements indicated a correlation with the N/P ratio as well. Increasing the latter resulted in smaller hydrodynamic radii, with the only exception in the case of the nanostars with the lowest grafting density, which showed aggregate formation. The polyplex stability was assessed with the ΔT assay. It was shown, that at high N/P ratios polyplexes in HBG solution have an increased stability over polyplexes formed in NaCl solution (150 mM). Additional pH measurements indicated a pH effect that leads to an alteration in the charge density. Transfection studies were conducted in different cell lines (CHO-K1, HEK-293, L929 and Jurkat) by formation of polyplexes with different variants of the nanostar library and a plasmid coding for the green fluorescent protein (GFP). Transfection efficiencies and cytotoxicity varied systematically with the nano-star architecture and the N/P ratio. The arm density was particularly important, with values of approximately 0.06 arms/nm2 yielding the best results. Additionally, the cellular magnetism was examined as well: Cells with associated nano-stars became magnetic and could be separated from the non-magnetic cell population via application of an external magnetic field. No statistical significant correlation was found between the gene delivery potential of a nano-star and its ability to render the cells magnetic. However, a clear trend was observed for transfections with low grafting density nano-stars, which resulted in a high proportion of magnetic cells. Furthermore, end-capping the PDMAEMA-arms with PDEGMA blocks (Poly(di(ethylene glycole)methyl ether methacrylate) showed significantly improved serum compatibility under transfection conditions. In the last chapter of the thesis, CHO-K1 cells were transfected with the nano-star library and fixed chemically after varied incubation times for TEM (transmission electron microscopy). Intracellular aggregations were observed and documented for all examined nano-stars. Interestingly, the nanostars colocalized with MVBs (“multivesicular bodies”), presumably late endosomes or heterolysosomes. No free nanoparticles were found in the cytoplasm or in the cell nucleus. Furthermore it was demonstrated, how the electron energy loss spectroscopy (EELS) enabled the discrimination between nanoparticle aggregations and contrasted biological structures of the sample