Chromosome dynamics during cell divisions in Drosophila melanogaster: The role of Rad21 in meiotic cohesion and dynamic analysis of the condensin subunit CapG in early embryonic mitotic divisions

Titelangaben

Nagarkar, Sonal:
Chromosome dynamics during cell divisions in Drosophila melanogaster: The role of Rad21 in meiotic cohesion and dynamic analysis of the condensin subunit CapG in early embryonic mitotic divisions.
Bayreuth , 2010
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Faithful segregation of genetic material is an essential hallmark of cell division. In eukaryotic cells, the DNA is replicated during S phase into two identical copies, which reside intimately paired (cohesed) in the nucleus as dispersed and entangled interphase chromatin fibers. At the onset of mitosis, the chromatin fibers start to resolve and by the end of metaphase they are compacted and individualized into a pair of cylindrical structures called sister chromatids, which remain connected until anaphase onset by residual sister chromatid cohesion in their centromeric regions. The compaction process is known as chromosome condensation, which is a prerequisite for accurate segregation of sister chromatids in anaphase. Chromosome condensation and sister chromatid cohesion require multisubunit protein complexes, the condensin and the cohesin complexes, respectively. Both complexes are composed of two core SMC subunits and a set of non-SMC subunits, which are conserved among most eukaryotes. In the first part of my thesis, I have analyzed the localization and dynamic behavior of a functional, EGFP-fused variant of CapG, one of the non-SMC subunits of the condensin I complex in Drosophila melanogaster. In vivo fluorescence microscopy of early embryonic mitotic divisions revealed that CapG-EGFP is mainly nuclear during interphase and that it starts to enrich at centromeric proximal regions in late interphase. Thereafter, CapG-EGFP spreads onto the chromosome arms concomitantly with the initiation of chromosome condensation (ICC) and loading is complete already in prophase at the time of nuclear envelope breakdown. Furthermore, FRAP analyses revealed that a major proportion of CapG-EGFP is stably bound to chromatin during metaphase and only a minor fraction shows a dynamic association with chromatin. These results are similar, but not identical, to findings previously obtained for another non-SMC subunit, CapH/Barren, suggesting interactions of the individual non-SMC subunits with chromatin outside a bona fide condensin complex. Since a non-SMC cohesin subunit homologous to the typical meiotic Rec8 protein found in other eukaryotes appears to be missing in Drosophila, I have assessed in the second part of my thesis a possible cohesive role for the mitotic subunit Rad21 during female meiosis. Furthermore, a potential redundancy during oogenesis between Rad21 and another candidate cohesin subunit, C(2)M, was analyzed. Forced proteolysis of Rad21 during oogenesis resulted in delocalization of the canonical cohesin core subunit Smc1 from oocyte chromatin. Furthermore, immunofluorescence and fluorescence in situ hybridization analyses revealed a high proportion of premature homolog disjunction and premature sister chromatid separation in the developing mutant oocytes and also during the meiotic divisions. Moreover, it was established that Rad21 has a role in the maintenance of the synaptonemal complex (SC), as shown by delocalization of the transversal SC component C(3)G. Taken together, these results suggest that Rad21 is indeed involved in sister chromatid cohesion during female meiosis in D. melanogaster. Since in the absence of Rad21 and the concomitant presence of C(2)M meiotic sister chromatid cohesion is compromised, Rad21 appears to play the major role in meiotic sister chromatid cohesion in D. melanogaster and a functional redundancy between C(2)M and Rad21 is unlikely.

Abstract in weiterer Sprache

Die akkurate Verteilung des genetischen Materials ist ein wesentliches Merkmal der Zell¬teilung. In eukaryontischen Zellen werden während der DNA Replikation zwei identische Kopien der DNA erzeugt, die zunächst in der Interphase eng gepaart als dekondensierte und miteinander verwickelte Chromatinfasern vorliegen. Zu Beginn der Mitose werden die Chromatin¬fasern entwirrt und kondensiert, bis sie am Ende der Metaphase als individuali¬sierte zylindrische Strukturen vorliegen, die bei höheren Eukaryonten als so genannte Schwes¬terchromatiden lichtmikroskopisch sichtbar werden. Lediglich im Zentromerbereich werden sie noch durch Schwesterchromatiden-Kohäsion zusammen gehalten. Der Prozess der Chromosomenkondensation ist eine Voraussetzung für die korrekte Segregation der Schwes¬ter¬chromatiden in der folgenden Anaphase. Chromosomenkondensation und Schwester¬chromatiden-Kohäsion beruhen auf der Aktivität der Multiproteinkomplexe Kondensin und Kohäsin. Beide Komplexe bestehen aus je zwei Kern-SMC Untereinheiten und einer Gruppe von nicht-SMC Untereinheiten, die innerhalb der meisten Eukaryonten konserviert sind. Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich die Lokalisation und das dynamische Verhalten einer biologisch funktionellen EGFP-markierten Variante von CapG untersucht, einer nicht-SMC Untereinheit des Kondensin I-Komplexes aus Drosophila melanogaster. Fluoreszenz¬mikroskopische Analysen von frühen mitotischen Teilungen in Drosophila- Embryonen zeigten, dass CapG-EGFP in der Interphase nukleär angereichert ist und in der späten Inter¬phase anfängt, präferentiell an zentromere Bereiche zu lokalisieren. Mit dem Beginn der Chromosomenkondensation breitet sich CapG-EGFP entlang der Chromosomenarme aus, und die maximale Chromatinassoziation ist bereits in der Prophase zum Zeitpunkt der Auflösung der Kernhülle erreicht. Weiterhin ergaben FRAP-Analysen, dass während der Metaphase ein großer Anteil des CapG-EGFP stabil ans Chromatin gebunden ist, und nur ein kleiner Teil dynamisch mit dem Chromatin assoziiert ist. Diese Ergebnisse sind ähnlich, wenn auch nicht identisch, wie Resultate einer früheren Studie zur Lokalisation und Dynamik einer andern nicht-SMC Kondensin I Untereinheit (CapH/Barren). Dieser Sachverhalt legt Interaktionen der einzelnen nicht-SMC Untereinheiten mit dem Chromatin außerhalb eines kanonischen Kondensin-Komplexes nahe. In Drosophila ist bisher kein Homolog zu der meiotischen nicht-SMC Kohäsin-Untereinheit Rec8 identifiziert worden, während in anderen Eukaryonten solche Homologe in den meisten Fällen beschrieben wurden. Deswegen habe ich im zweiten Teil meiner Arbeit eine mögliche Rolle der mitotischen nicht-SMC Kohäsin-Untereinheit Rad21 in der Schwes¬terchromatiden-Kohäsion während der weiblichen Meiose untersucht. Zusätzlich wurde eine mögliche funktionelle Redundanz zwischen Rad21 und C(2)M abgeklärt, welches als weiteres Kandidatenprotein für eine meiotische Kohäsin-Untereinheit diskutiert wird. Erzwungene Proteolyse von Rad21 während der Oogenese hat eine Delokalisation der kanonischen Kern-Kohäsin-Untereinheit Smc1 vom Chromatin der Oozyte zur Folge. Weiterhin zeigten Immun-fluoreszenzanalysen und Fluoreszenz in situ-Hybridisierungs-Experimente einen hohen Anteil von frühzeitiger Trennung der homologen Chromosomen und frühzeitiger Schwester¬chromatidentrennung in der sich entwickelnden Oozyte sowie während der meiotischen Teilungen. Darüber hinaus deutet die Delokalisation von C(3)G, einer transversalen Kompo¬nente des synaptonemalen Komplexes, auf eine Rolle von Rad21 bei der Aufrechterhaltung des synaptonemalen Komplexes hin. Zusammengenommen legen die Ergebnisse nahe, dass Rad21 in der Tat bei der Schwesterchromatiden-Kohäsion während der Meiose in D. melano¬gaster Weibchen eine wesentliche Rolle spielt. Dagegen scheint Rad21 nicht redundant mit C(2)M zu sein, da die Abwesenheit von Rad21 auch in der Präsenz von C(2)M zu klaren Kohäsionsdefekten führt.