Eukaryotic chromosome segregation: New aspects of separase regulation by securin, Cdk1, PP2A and auto-cleavage

Titelangaben

Böttger, Franziska:
Eukaryotic chromosome segregation: New aspects of separase regulation by securin, Cdk1, PP2A and auto-cleavage.
Bayreuth , 2011
( Dissertation, 2011 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

The universal triggering event of eukaryotic chromosome segregation is the proteolytic cleavage of chromosomal cohesin by separase. The activity of this essential but potentially also very dangerous protease must be tightly controlled. Prior to the onset of anaphase separase is kept inactive by association with either securin or cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) in conjunction with cyclin B1. Only when all chromosomes interact properly with the mitotic spindle apparatus does the anaphase promoting complex or cyclosome (APC/C), a multisubunit E3 ligase, mediate the ubiquitylation of securin and cyclin B1. Their subsequent proteasomal degradation then releases active separase. Murine embryonic stem cells, which lack securin and express a Cdk1-resistant phosphorylation site mutant separase are viable. Thus, additional regulations of sister chromatid separation by separase must exist. It was reported that human separase cleaves not only cohesin but also itself and, furthermore, that it interacts with protein phosphatase 2A (PP2A). However, the functions of separase's auto-cleavage and PP2A-interaction remain enigmatic. Moreover, securin was reported to also interact with PP2A but, strangely, with a different isoform of the phosphatase. Thus, the question needs clarification of whether separase or securin or both interact with which isoform of PP2A. In this study, further insights into the relationship between separase auto-cleavage and PP2A binding are presented. Phosphorylation of a serine residue in close proximity to the major cleavage site of separase was found to stimulate auto-cleavage of separase. Interestingly, a quantitative mass-spectrometric approach (SILAC) identified this serine residue as a substrate of separase-bound PP2A. Furthermore, a point mutation within separase was identified, which totally abolishes PP2A binding and which maps to the immediate vicinity of the auto-cleavage sites. Thus, PP2A prevents the auto-cleavage of separase both catalytically and sterically. It could further be shown that non-cleavable separase exhibits increased association with PP2A and that forced cleavage of separase displaces PP2A. Taken together, these results demonstrate that auto-cleavage and PP2A binding constitute two antagonistic mechanisms of separase regulation. Evidence is provided that the interaction of PP2A with securin is indirect and bridged by separase, and that it is the B56- and not the B55-isoform of PP2A which associates with the separase-securin complex. Moreover, free securin is shown to be degraded in early mitosis in a phosphorylation- and APC/C-dependent manner, while separase-associated securin is kept dephosphorylated and, thus, protected by PP2A. Securin levels are frequently increased in tumors. In normal cells, the early removal of excessive securin might later ensure swift separase activation and anaphase onset, thereby contributing to faithful chromosome segregation.

Abstract in weiterer Sprache

Das auslösende Ereignis eukaryotischer Chromosomensegregation ist die proteolytische Spaltung des chromosomalen Cohesins durch Separase. Die Aktivität dieser wichtigen, aber potentiell auch sehr gefährlichen Protease muss streng reguliert werden. Vor Beginn der Anaphase wird Separase durch Assoziation mit Securin oder Cyclin-abhängiger Kinase 1 (Cdk1) in Verbindung mit Cyclin B1 inaktiv gehalten. Erst wenn alle Chromosomen korrekt mit dem mitotischen Spindelapparat assoziiert sind, wird der Anaphase Promoting Complex oder Cyclosome (APC/C), eine E3-Ligase, aktiviert und vermittelt die Ubiquitinierung von Securin und Cyclin B1. Der anschließende proteasomale Abbau dieser Inhibitoren entlässt Separase in aktivierter Form. Murine embryonale Stammzellen, denen Securin fehlt und die eine Cdk1-resistente Separase-Mutante überexprimieren, sind lebensfähig. Daher muss es zusätzliche Regulationsmechanismen für Separase geben, welche die Schwesterchromatid-Trennung regulieren. Es wurde berichtet, dass menschliche Separase nicht nur Cohesin sondern auch sich selbst spalten kann. Außerdem interagiert Separase mit Protein Phosphatase 2A (PP2A). Allerdings sind die Funktionen dieser Selbstspaltung und PP2A-Interaktion noch immer ungeklärt. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Securin auch mit PP2A interagieren kann, allerdings mit einer anderen Isoform. Daher muss die Frage geklärt werden, ob Separase oder Securin oder beide mit welcher Isoform von PP2A interagieren. In dieser Studie werden neue Einblicke in die Beziehung zwischen Separase-Selbstspaltung und PP2A-Bindung geliefert. Es konnte die Phosphorylierung eines Serinrestes in unmittelbarer Nähe zu der wichtigsten Selbstspaltstelle von Separase festgestellt werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass diese die Selbstspaltung der Separase stimuliert. Interessanterweise konnte in einem quantitativen massen-spektrometrischen Ansatz (SILAC) dieser Serinrest als Substrat der Separase-gebundenen PP2A identifiziert werden. Darüber hinaus konnte eine Punktmutation in Separase identifiziert werden, welche die Interaktion mit PP2A verhindert und in umittelbarer Nähe zu den Selbstspaltstellen liegt. PP2A verhindert also die Selbstspaltung der Separase sowohl auf eine katalytische als auch auf eine sterische Art. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass nicht-spaltbare Separase stärker mit PP2A interagiert und erzwungene Spaltung PP2A von Separase verdrängt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Selbstspaltung und PP2A-Bindung zwei antagonistische Mechanismen der Separaseregulation darstellen. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Interaktion von PP2A mit Securin indirekt ist und durch Separase überbrückt wird. Außerdem wurde gezeigt, dass es sich hierbei um die B56- und nicht um die B55-Isoform der PP2A handelt. Weiterhin konnte ein phosphorylierungs- und APC/C-abhängiger Abbau von Separase-freiem Securin in früher Mitose gezeigt werden, während Separase-assoziiertes Securin durch PP2A dephosphoryliert und geschützt wird. In Tumoren sind die Securinmengen oft erhöht. In normalen Zellen könnte die frühzeitige Entfernung des überflüssigen Securins später eine rasche Separase-Aktivierung sowie einen zeitgerechten Anaphase-Beginn gewährleisten und damit eine akkurate Chromosomensegregation ermöglichen.