Charakterisierung der Diffusion und der Reaktionskinetik von peripheren Membranproteinen in lebenden Zellen

Titelangaben

Hoffmann, Julia:
Charakterisierung der Diffusion und der Reaktionskinetik von peripheren Membranproteinen in lebenden Zellen.
Bayreuth , 2016 . - 151 S.
( Dissertation, 2016 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Bestimmung der Bindungskinetik von peripheren Membranproteinen auf ihren Targetmembranen in vivo mit der Methode Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) untersucht. Assoziations-Dissoziations-Prozesse von Proteinen mit Membranen werden häufig anhand der charakteristischen Fluoreszenzerholungszeit τ quantifiziert. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass die charakteristische Zeit τ nicht nur von der Bindungskinetik der Proteine abhängt, sondern auch durch die Größe und die Anzahl der Targetmembranen im System bestimmt wird. Diese zusätzlichen Parameter müssen deswegen bei Untersuchungen der Bindungskinetik von Proteinen auf Membranen mit FRAP berücksichtigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Regulation und die Organisation von ER exit sites (ERES), auf den Proteinexport spezialisierten Domänen der ER-Membran, untersucht. Hierzu wurde mit den Methoden Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und FRAP die Diffusion des Regulatorproteins Sec16 im Zytoplasma sowie seine Assoziation und Dissoziation mit den ERES vermessen. Es zeigte sich, dass eine Anbindung von Sec16 an ERES nur in Wechselwirkung mit dem COPII-Proteinkomplex möglich ist, welcher die Produktion von Transportvesikeln an den ERES reguliert. Folglich kann Sec16 an den ERES keine organisierende Rolle für die COPII-Proteine im Sinne eines Scaffold-Proteins übernehmen. Weiterhin wurde festgestellt, dass eine Phosphorylierung die Oligomerisierung von Sec16 auf der ER-Membran beeinflusst: während das Protein im phosphorylierten Zustand als Monomer oder in kleinen Komplexen auf der ER-Membran diffundiert, findet im unphosphorylierten Zustand Oligomerisierung zu größeren Komplexen statt. Die Oligomerisierung und die Bildung von COPII-Sec16-Komplexen sind dabei zwei konkurrierende Reaktionen auf der ER-Membran. Die Ergebnisse gingen in die Entwicklung eines Modells der Entstehung von ERES in lebenden Zellen ein, das auf der Selbstorganisation des Proteins Sec16 und des COPII-Komplexes basiert. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der löslichen Proteindomäne und des Aktivitätszustandes einer biochemisch modifizierten Variante des Proteins N-Ras auf sein Verhalten im Zytoplasma hin untersucht. Es zeigte sich, dass die Lokalisation des Proteins im Zytoplasma von der löslichen Domäne anhängt, während die Diffusion des Proteins auf der ER-Membran von seinem Aktivitätszustand beeinflusst wird.

Abstract in weiterer Sprache

In the first part of this thesis the determination of binding kinetics via fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of peripheral membrane proteins on thier target membranes was investigated in vivo. These association-dissociation processes are commonly quantified by means of characteristic recovery time τ. The result of this work show that τ values are determined not only by the binding kinetics of proteins, but also by the size and number of target structures in the system. Hence, in investigations of binding kinetics of proteins on their target membranes via FRAP these additional parameters should be considered. In the second part of this thesis the regulation and the formation of ER exit sites (ERES), specialized domains of the ER membrane for protein export, was investigated. For this purpose the methods fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and FRAP were used to measure diffusion of the regulator protein Sec16 in cytoplasm as well as its association and dissociation with ERES. The studies have shown that binding of Sec16 to ERES is only possible in interaction with the COPII protein complex, which regulates the production of transportvesicles at ERES. Sec16 therefore can not have any organizing role for COPII proteins in the sense of a scaffold protein. Further it was found that phosphorylation influence the oligomerization of Sec16: in phosphorylated state Sec16 proteins diffuse as monomers or in small complexes on the ER membrane, whereas in unphosphosphorylated state oligomerization to large complexes takes place. The oligomerization is competed by the formation of Sec16-COPII complexes on the ER membrane. These results contributed to a model of the formation of ERES in cells which is based on self-organization of Sec16 and the COPII complex. In the last part of this thesis the influence of the soluble structure domain and the activation state of the protein N-Ras on its behavior in the cytoplasm was investigated. Measurements have shown that the localization of this protein in the cytoplasm depends on the soluble structure domain, whereas its diffusion on the ER membrane is influenced by its activation state.