Biochemical and structural characterization of Sirtuins from mammals and Thermotoga maritima

Titelangaben

Lakshminarasimhan, Mahadevan:
Biochemical and structural characterization of Sirtuins from mammals and Thermotoga maritima.
Bayreuth , 2012
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Sirtuins are NAD+ dependent protein deacetylases involved in regulation of metabolism, age related diseases and are suggested to mediate lifespan extending effects of calorie restriction. Mammals contain seven Sirtuin soforms with various cellular localizations and substrate preferences. This work focuses on the structural and biochemical characterization of several mammalian Sirtuin isoforms, with main emphasis on the largest member of the family, Sirt1.Analysis of various Sirt1 constructs using analytical ultracentrifugation and electron microscopy techniques identified it to be a monomer, similar to other mammalian isoforms. Comparison of activity between different Sirt1 constructs indicates that the termini might be involved in regulating the protein’s activity. It could be shown that the catalytic domain of Sirt1 is sufficient for its activation by the lifespan extending polyphenol resveratrol and that resveratrol can directly bind to Sirt1. Using a peptide array harboring all known mammalian acetylation sites several novel substrates for Sirt1 were identified and shown that resveratrol and other small molecules can modulate Sirt1 dependent deacetylation of substrate peptides and that the effect is specific for the sequence of the substrate site. This finding reveals exciting possibilities for the development of new modulators targeting only specific substrates of Sirt1. These compounds can further be used in analyzing the functions of Sirtuins in vivo and can also serve as attractive leads for developing Sirt1 specific drugs. Studies on the mitochondrial isoform Sirt3 revealed that Zinc is essential for the structural integrity of Sirtuins. Investigations on Sirt5, also a mitochondrial Sirtuin appears to indicate that it is insensitive to nicotinamide (a physiological inhibitor of Sirtuins). Studies on the nucleolar isoform Sirt7 identified Thr224 to be phosphorylated, and play a role in the enzyme’s activity. The thermotoga maritima Sirtuin Sir2Tm was used as a model system for structural characterization of Sirt1. The crystal structure of Sir2Tm in complex with Ex-527, a potent Sirt1 inhibitor was solved, which combined with biophysical studies offers information about Ex-527 binding and inhibition. Close contacts between Ex-527 and some form of ADP-ribose, possibly the product O-acetyl-ADP-ribose (which is not yet fully verified) in the closed enzyme conformation prevent the release of products, thereby stalling the enzymatic reaction. These results offer insights into the isoform specific inhibition of Sirtuins by Ex-527 and provide information for further improvement of Sirt1 specific inhibitors.

Abstract in weiterer Sprache

Sirtuine sind NAD+- abhängige Proteindeacetylasen, die an Stoffwechselregulation und der Entstehung altersbedingter Krankheiten beteiligt sind; zudem wird angenommen, dass sie die lebensdauerverlängernde Wirkung von „caloric restriction“ vermitteln. Bei Säugetieren kommen sieben Sirtuin Isoformen vor, die sich in ihren zellulären Lokalisierungen und Substratpräferenzen unterscheiden. Diese Arbeit richtet ist fokussiert auf die strukturelle und biochemische Charakterisierung verschiedener Sirtuin-Isoformen aus Säugern, mit Schwerpunkt auf Sirt1, dem größtem Mitglied der Sirtuinfamilie. Die Analyse verschiedener Sirt1-Konstrukte mittels analytischer Ultrazentrifugation und Elektronenmikroskopie zeigte, dass Sirt1 als Monomer vorliegt, ähnlich wie die anderen Isoformen aus Säugern. Ein Vergleich der Aktivitäten der verschiedenen Sirt1-Konstrukte weist darauf hin, dass die Termini an der Regulierung der Proteinaktivität beteiligt sein könnten. Es konnte gezeigt werden, dass die katalytische Domäne von Sirt1 ausreicht für die Aktivierung durch das lebensdauerverlängernde Polyphenol Resveratrol und dass Resveratrol direkt an Sirt1 binden kann. Unter Verwendung eines Peptidarrays, der alle bekannten Acetylierungsstellen aus Säugerproteinen beinhaltet, wurden mehrere neue Substrate für Sirt1 identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass Resveratrol und andere Kleinmoleküle die Sirt1-abhängige Deacetylierung von Substratpeptiden modulieren können, und zwar in Abhängigkeit von der Substratsequenz. Dieses Ergebnis eröffnet außergewöhnliche Möglichkeiten für die Entwicklung neuer Modulatoren, die nur die Deacetylierung einiger der Sirt1-Substrate beeinflussen. Diese Verbindungen können dann für die Funktionsanalyse von Sirtuinen in vivo genutzt werden, und sie können als vielversprechende Leitstrukturen für die Entwicklung hochspezifischer Sirt1-Wirkstoffen dienen. Studien an der mitochondrialen Isoform Sirt3 zeigen, dass Zink für die strukturelle Integrität der Enzyme notwendig ist. Untersuchungen an Sirt5, ebenso ein mitochondriales Sirtuin, scheinen darauf hinzuweisen, dass es unempfindlich ist gegen Nicotinamid (ein physiologischer Sirtuin Inhibitor). Untersuchungen an der nukleolaren Isoform Sirt7 identifizieren eine Phosphorylierung an Thr224, die die Enzymaktivität zu beeinflussen scheint. Das Thermotoga maritima Sirtuin Sir2Tm wurde als Modellsystem für die strukturelle Charakterisierung von Sirt1 verwendet. Die Kristallstruktur von Sir2Tm in Komplex mit Ex6. 527, einem potenten Sirt1 Inhibitor, wurde gelöst. In Verbindung mit biophysikalischen Untersuchungen ergaben sich daraus Erkenntnisse zu Bindung und Inhibitionsmechanismus von Ex-527. Eine räumlich enge Nachbarschaft zwischen Ex-527 und einer Form von ADPRibose, möglicherweise dem Produkt O-acetyl-ADP-Ribose (noch nicht vollständig verifiziert) in der geschlossenen Enzymkonformation verhindert die Produktfreisetzung und stoppt dadurch die enzymatische Reaktion. Diese Ergebnisse bieten Einsichten in die Isoformspezifische Hemmung von Sirtuinen durch Ex-527 und liefern Information für die weitere Verbesserung von Sirt1-spezifischen Inhibitoren.