Zentrale Cis- und Transregulation der pflanzlichen Hypoxieantwort

Titelangaben

Gasch, Philipp:
Zentrale Cis- und Transregulation der pflanzlichen Hypoxieantwort.
Bayreuth , 2015 . - VII, 158 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Pflanzen sind obligat aerobe Organismen mit einer sessilen Lebensweise. Aus diesen Gründen ist die Fitness von Pflanzen von der lokalen Sauerstoffverfügbarkeit abhängig. Sinkt die intrazelluläre Sauerstoffkonzentration (Hypoxie), zum Beispiel nach starken Regenfällen, während Staunässe oder Überflutung unter den Km-Wert der Cytochrom-c-Oxidase, erfährt die Pflanze eine Energiekrise durch ATP-Mangel. Um dem entgegenzuwirken, haben Pflanzen Merkmale entwickelt, die die Verfügbarkeit von Sauerstoff entweder erhöhen, oder dessen Verbrauch herabsetzen. Dem größten Teil solcher induzierbaren morphologischen und metabolischen Remodellierungen liegt eine differenzielle Genregulation zugrunde. Die zentrale Hypoxieantwort von Arabidopsis thaliana wird durch eine systemische Induktion von 49 core Genen, darunter ALCOHOL DEHYDROGENASE 1 (ADH1), PYRUVAT DECARBOXYLASE 1 (PDC1), LOB DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 41 (LBD41), HYPOXIA RESPONSE ATTENUATOR 1 (HRA1), PLANT CYSTEINE OXIDASE 1 (PCO1) und PCO2 definiert. Etwa 50 % dieser Gene sind Ziele von group VII-ERF Transkriptionsfaktoren, von welchen in Arabidopsis thaliana mindestens fünf Mitglieder vorkommen. HYPOXIA RESPONSIVE ERF 1 (HRE1) und HRE2 werden unter Hypoxiebedingungen transkriptionell aktiviert, während RELATED TO AP2 2 (RAP2.2), RAP2.3 und RAP2.12 konstitutiv aktiviert vorliegen. Alle group VII-ERFs von Arabidopsis thaliana werden posttranslational durch einen Zweig des N-end-rule Pathways (NERP) sauerstoffabhängig destabilisiert, während Sauerstoffmangel deren Transaktivität über eine nukleare Akkumulation auslöst. Die Redundanz von group VII-ERFs wurde vorher auf den Ebenen der Hypoxieanfälligkeit und Genregulation untersucht. Dennoch sind der quantitative Einfluss jedes Mitglieds, der zugrundeliegende Mechanismus der Redundanz und mögliche Hierarchien unter group VII-ERFs nicht ausreichend verstanden. Bei Wiederbelüftung kommt es zu einer posthypoxischen Abnahme der mRNA von group VII-ERF Zielgenen, welche als ebenso überlebensnotwendig angesehen wird, wie deren anfängliche Hypoxieinduktion. Da RAP2.12 länger im Nukleus residiert als die mRNA seiner Zielgene, wird von einem aktiven Repressionsmechanismus ausgegangen, welcher nicht allein durch das Wirken des Repressors HRA1 erklärt werden kann. Die Basis der vorliegenden Arbeit war die Isolation von Promotoren von Hypoxiemarkergenen. Der LBD41-Promotor, welcher in einer NERP-Mutante und unter Hypoxie aktiv war, wurde für ein Screening nach Transregulatoren der Hypoxieantwort genutzt. Dabei wurden zum einen group VII-ERFs als Aktivatoren der Hypoxieantwort bestätigt, und ein bis dahin noch unbekannter positiver Einfluss von RAP2.3 auf die Hypoxieinduktion entdeckt. Zum anderen wurden potenzielle Repressoren identifiziert, welche im ersten Teil dieser Arbeit genauer untersucht wurden. Dem REDOX RESPONSIVE TRANSCRIPTION FACTOR 1 konnte durch transiente Überexpression und knock out Analysen keine Funktion für die Regulation unter Sauerstoffmangel zugeschrieben werden. KANADI1 und ZINC FINGER PROTEIN 1 waren in der Lage, hypoxieresponsive Promotoren, wahrscheinlich jedoch unspezifisch, zu reprimieren. Mitglieder der Constans-like Familie enthüllten hingegen eine redundante Repressorfunktion, spezifisch für hypoxieresponsive Promotoren. LBD41 zeigte ebenso hypoxiespezifische Repressoreigenschaften, welche, im Gegensatz zu denen von HRA1, wahrscheinlich nicht auf einer Interaktion mit group VII-ERFs beruhten. Die Resequenzierung von Effektorkonstrukten enthüllte die Existenz eines kodierenden group VII-ERF Gens, welches starke Ähnlichkeiten zu RAP2.3 aufwies, jedoch nicht identisch mit diesem war. Genotypisierungsexperimente deuteten darauf hin, dass es sich bei diesem Gen um eine allelische Variante von RAP2.3 handelte, welche in manchen Ökotypen auftauchte. Überraschenderweise enthielten diese Ökotypen zusätzlich eine kodierende, intronfreie RAP2.3 Version, welche möglicherweise ein funktionales prozessiertes Pseudogen darstellte. Die funktionelle Redundanz von konstitutiv aktiven group VII-ERFs wurde mittels ADH-Aktivitätsmessung in stabilen Überexpressionslinien bestätigt. Mittels quantitativer realtime PCR (qRT-PCR)- Analysen mit Einzel- und Doppelnullallelen von RAP2.2 und RAP2.12 wurden beide als gleichrangige Hauptaktivatoren der Hypoxieantwort charakterisiert. Eine minimale Restexpression von Hypoxiemarkergenen bei Abwesenheit von RAP2.2 und RAP2.12 ließ auf eine physiologisch relevante Beteiligung von RAP2.3 schließen. Die Messung der Überflutungsanfälligkeit von rap2.2/2.12 Mutanten wurde durch natürliche Schwankungen der Überlebensrate eingekreuzter Ökotypen erschwert. RAP2.2 wurde im weiteren Verlauf als hypoxiespezifischer transkriptioneller Aktivator charakterisiert. Mittels induzierter nuklearer Akkumulation eines RAP2.2-Fusionsproteins konnten direkte Zielgene des Transkriptionsfaktors identifiziert werden. Mittels Deletionskartierung von Promotoren direkter RAP2.2-Zielgene wurde eine 33 bp lange, positiv regulatorische Sequenz isoliert, welche durch RAP2.2, RAP2.3 und RAP2.12, sowie unter Hypoxie aktiviert wurde. Mithilfe einer neu etablierten Strategie, welche klassische und phylogenetische Motivvorhersagen kombinierte, wurde ein konserviertes Motiv identifiziert. Dieses war sowohl in der 33bp langen Sequenz, als auch in nativen Promotoren funktional, was durch Transaktivierungsexperimente mit punktmutierten und deletierten Sequenzen nachgewiesen wurde. Das Motiv wies Sequenzähnlichkeiten zum Anaerobic Responsive Element auf, was sich unter anderem durch eine gemeinsame, direkte Interaktion mit group VII-ERFs in einem Hefe-1-Hybridsystem, auf funktionaler Ebene widerspiegelte. Es wurde deshalb als ARE-like element (ALE) bezeichnet.

Abstract in weiterer Sprache

The sessile and aerobic nature of plants links their fitness to the surrounding oxygen availability. After heavy rainfalls, during waterlogging or submergence, intracellular oxygen concentration can drop below the Km of the Cytochrome-c-Oxidase causing an ATP insufficiency. To counteract low internal oxygen (hypoxia), plants developed traits that improve gas supply or reduce oxygen consumption. The majority of such induced morphological and metabolic adaptations are caused by differential gene expression. In Arabidopsis thaliana the central hypoxia response is defined by the induction of 49 core genes, among them ALCOHOL DEHYDROGENASE 1 (ADH1), PYRUVAT DECARBOXYLASE 1 (PDC1), LOB DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 41 (LBD41), HYPOXIA RESPONSE ATTENUATOR 1 (HRA1), PLANT CYSTEINE OXIDASE 1 (PCO1) and PCO2. Approximately 50 % of these genes are positively regulated by group VII-ERF transcription factors encoded by at least five members in the Arabisopsis thaliana genome. HYPOXIA RESPONSIVE ERF 1 (HRE1) and HRE2 are activated under low oxygen whereas RELATED TO AP2 2 (RAP2.2), RAP2.3 and RAP2.12 are constitutively transcribed. All members of the Arabidopsis thaliana group VII-ERFs are posttranslationally destabilized by a branch of the N-end-rule pathway (NERP), and accumulate in the nucleus upon hypoxia triggering their trans-activity. Redundancy of group VII-ERFs has been investigated in terms of low oxygen survival and differential gene regulation. However, quantitative impact of each member, as well as the redundancy causing mechanism and possible hierarchical relationships were not satisfiyingly understood. Upon reaeration, the number of low oxygen marker gene transcripts decreases, which is regarded as important for survival under low oxygen conditions as their previous induction. RAP2.12 shows nuclear presence during the decline of its target transcripts pointing to an active repression mechanism. However, the previously identified repressor of hypoxia responsive genes HRA1 provides no sufficient explanation for post hypoxic repression. This work started with the isolation of upstream sequences from hypoxia marker genes. The LBD41-Promoter which showed strong activity in NERP mutants and during hypoxic conditions was used to screen for trans-regulators of the hypoxic response. The activating function of group VII-ERFs was confirmed and the previously unknown positive impact of RAP2.3 was discovered. Also potential repressors of the hypoxia responsive promoter were identified and further characterized. For REDOX RESPONSIVE TRANSCRIPTION FACTOR 1 no regulatory function during the hypoxic response could be confirmed via transient overexpression and knock out mutant analyses. KANADI1 and ZINC FINGER PROTEIN 1 likely possessed unspecific repressive capacities on group VII-ERF regulated promoters. Members of the Constans-like family revealed redundant repressor functions, specific for hypoxia responsive promoters. Also LBD41 showed hypoxia specific repressor capacities which, unlike HRA1, did not depend on the presence of group VII-ERFs. Resequencing of effector constructs uncovered the existence of a coding group VII-ERF gene that was similar but not identical to RAP2.3. Genotyping data implied that this gene was an allelic variation of RAP2.3 which was present in a number of Arabidopsis accessions. Surprisingly, these ecotypes also contained a coding, intron less RAP2.3 isoform which possibly displayed a functional processed pseudogene. Functional redundancy of constitutively active group VII-ERFs was confirmed via measurement of ADH-activity in overexpression lines. Quantitative realtime PCR (qRT-PCR) analyses of rap2.2/2.12 single and double knock out lines showed that both act equally redundant as main activators of hypoxia responsive genes. Residual expression of NERP target genes in absence of RAP2.2 and RAP2.12 pointet to a physiologically relevant involvement of RAP2.3. The measurement of double mutant susceptibility towards submergence conditions was impeded by contrasting survival rates of the different ecotypes used. RAP2.2 was further characterized as a hypoxia specific transcriptional activator. Using a system, allowing for inducible nuclear accumulation of a RAP2.2-fusion protein, direct target genes of RAP2.2 were identified. Via deletion mapping of RAP2.2 target promoters, a 33bp long region was localized, that was activated through RAP2.2, RAP2.3 and RAP2.12 and under hypoxic conditions. Using a newly developed strategy that combines classical prediction approaches with phylogenetic analyses a conserved motif was found. In transactivation experiments of substitutional mutations and deletions this motif turned out to be essential in the 33bp long region and in two native hypoxia responsive promoters. The motif showed sequence similarity to the Anaerobic Responsive Element (ARE) which was mirrored, for example, by a shared direct interaction with group VII-ERFs in a yeast-1-hybrid assay. It was therefore named ARE-like element (ALE).