Komplexkonjugate bioaktiver Flavonoide & Naphthochinone und Photoaktivierung von Carboplatin für Studien der intrazellulären Verteilung

Titelangaben

Spörlein-Güttler, Cornelia:
Komplexkonjugate bioaktiver Flavonoide & Naphthochinone und Photoaktivierung von Carboplatin für Studien der intrazellulären Verteilung.
Bayreuth , 2015 . - III, 203 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Zu den wesentlichen Hindernissen in der modernen Krebstherapie zählen zum einen die Resistenz der Tumorzellen gegenüber der Apoptose sowie die Multiresistenz gegen Zytostatika und zum anderen die generelle Toxizität vieler Medikamente gegenüber gesundem Gewebe.18 Mit Hilfe von antitumoralen Naturstoffliganden, speziell Flavonoiden und Naphthochinonen, und geeigneten, bioaktiven Metallfragmenten sollten Koordinationsverbindungen hergestellt werden, um dieser Problematik entgegen zu wirken.131,142 In dieser Arbeit wurden durch das Zusammenspiel der beiden Wirkeinheiten aktivere und selektivere Zytostatika dargestellt, welche anschließend biologischen Tests unterzogen wurden. Als bidentate Flavonoidliganden wurden Wogonin (17), Chrysin (23), Apigenin (12), Genistein (13) und Xanthohumol (24) und als Naphthochinonliganden Juglon (38), Plumbagin (37) und dessen Derivate verwendet. In Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Rambold wurde Parietin (107) aus Flechten isoliert und diente als weiterer Ligand in der Komplexierung von verschiedenen Metallen, u.a. von Kupfer, Eisen, Platin, Ruthenium, Aluminium und Gallium. Während die Komplexierung von Xanthohumol (24) und Parietin (107) zu nicht löslichen Feststoffen oder Zersetzungsprodukten führte, konnten mit den anderen Flavonoiden und Napthochinonen z.T. sehr gute Ergebnisse erzielt werden. Die Darstellung der bekannten Cu(II)-Komplexe 117, 122 und 126 aus den Liganden 23, 13 und 12 erfolgte teils mit leichten Abweichungen nach Zeng et al..36 Hierbei war deutlich ersichtlich, dass sowohl die Liganden, als auch die Cu(II)-Komplexe keine Aktivität gegenüber nicht malignen Fibroblasten zeigten, während die Aktivität gegenüber resistenten Zelllinien (KB-V1/Vbl, MCF-7/Topo) am größten war. Hervorzuheben sind die IC50-Werte des Cu(II)-Chrysin Komplex 117 und des Cu(II)-Genistein Komplex 122, welche einen einstelligen µM-Bereich (4,6 – 8,5) an beiden resistenten Krebszelllinien KB-V1/Vbl und MCF-7/Topo aufwiesen.36 Die Zellzyklusanalysen der drei Komplexe 117, 122 und 126 zeigten jeweils einen ausgeprägten G2/M-Arrest im Vergleich zu den entsprechenden Liganden 23, 13 und 12.36 Mit Hilfe des Woundhealing-Assay konnte die migrationshemmende Eigenschaft der Cu(II)-Komplexe dargelegt werden, wobei 122 den größten Effekt zeigte.36 Anhand der Färbung von Aktin-Zytoskelett und Beta-Catenin behandelter 518A2-Zellen, sowie der Gelatinezymographie, konnte die antimetastatische Wirkung der Substanzen 13, 122, 12 und 126 gezeigt werden. Diese beruht demnach entweder auf der Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts, der vermehrten Bildung von Cadherin-Catenin-Zell-Zell-Adhäsionspunkten oder auf der Modulation von MMP-Expression bzw. MMP-Sekretion.36 Die drei Liganden 23, 13 und 12 wurden mit weiteren Metallsalzen versetzt, um den Einfluss der unterschiedlichen Liganden und Metallzentren untereinander zu vergleichen. Aus den darstellbaren Metallkomplexen 118, 119 und 124 zeigten nur der Al(III)- 118 und Fe(III)-Chrysin Komplex 119 eine nennenswerte Aktivität an der HCT-116-Zelllinie mit IC50-Werten im Bereich von 8,7 – 12,1 µM. Als weiterer Flavonoidligand sollte Wogonin (17) dienen. Während der Darstellung von 17 konnte die von Huang et al. publizierte Synthese widerlegt werden.27 Es konnte nur Negletein (71) erhalten werden, dessen Komplexierung mit Cu(OAc)2 x H2O keine erhebliche Wirksteigerung an Krebszelllinien zeigte. Aus der Vorstufe von 17, dem Chalkon 20, konnten Metallkomplexe mit beachtlichen IC50-Werten dargestellt werden. Obwohl 20 bereits selbst eine gute Aktivität aufweist, konnten mit dem Cu(II)-Komplex 109 oder dem Fe(III)-Komplex 111 IC50-Werte an der 518A2- und HCT-116-Zelllinie im einstelligen µM-Bereich (3,8 – 7,5) erreicht werden. Desweiteren wurden neben den Flavonoiden Naphthochinone zur Darstellung von Metallkomplexen verwendet. Ru(II)-Plumbagin-Komplexe wurden ausgehend von den beiden Plumbaginhydrazon Verbindungen 135 und 136 dargestellt.71 An der resistenten Zelllinie KB-V1/Vbl erreichten die Ru(II)-Komplexe 137 – 139 IC50-Werte < 4 µM, 137 sogar unter 1 µM.71 Im Vergleich zu Plumbagin (37) selbst, zeigten die Komplexe 137 – 139 keine Auswirkung auf gesunde Zellen und gleichzeitig gesteigerte Wirkung gegenüber malignen Zellen, was sie zu neuen möglichen Anwärtern für Zytostatika werden lässt. Ein weiteres Plumbaginhydrazon, der Ferrocen-Komplex 142, zeigte ebenfalls keine schädliche Wirkung an gesundem Gewebe im Vergleich zu 37 und konnte einen IC50 Wert von 1,1 µM an den KB-V1/Vbl Zellen erreichen.71 Zusätzlich konnte ein IC50-Wert von 0,5 µM an den Hautkrebszellen dargelegt werden, sodass 142 eine größere Wirkung an verschiedenen Zelllinien aufweist, im Vergleich zu den Komplexen 137 – 139. Durch die Zellzyklus-Analysen konnte gezeigt werden, dass in einer dosis- und zeitabhängigen Weise die Verbindungen 137 und 142 zu einer Erhöhung der Menge apoptotischer Krebszellen führen, während 37 in den Zelllinien HCT-116 und KB-V1/Vbl einen G2/M-Arrest induziert.71 Eine wichtige Komponente des Wirkmechanismus von Plumbagin (37) ist die Modifikation der DNA, welche u.a. durch oxidative Schädigung durch erzeugte ROS oder durch Interkalation hervorgerufen wird. Bereits bei einer Konzentration von 10 µM ist die ROS-Produktion von 142 größer im Vergleich zu 37.71 Zudem verursachen die Derivate 137 und 142 im EMSA größere Shifts bei niedrigeren Konzentrationen als 37, was erhebliche Konformations-Veränderungen der behandelten linearen DNA aufzeigt.71 Mit Hilfe des fluoreszierenden P-gp-Substrats Calcein-AM konnte eine Hemmung des P-gp Transporters zu 50 % bzw. 80 % durch 137 und 142 erreicht werden, während 37 selbst keinen Einfluss auf diesen Efflux-Transporter hat. Dies steht im Einklang mit der Resistenz der KB-V1/Vbl-Zelllinie gegen Plumbagin (37). In Anlehnung an 142 wurde der Ferrocen-Komplex 149 basierend auf Juglon (38) dargestellt, welcher jedoch keine Aktivität gegenüber Krebszelllinien zeigte.71 Als weiterer Ligand sollte das Plumbaginderivat 106 dienen, welches mit Cu(OAc)2 x H2O versetzt wurde. Der Cu(II)-Komplex 150 erreichte an den Zelllinien HCT-116 und KB-V1/Vbl IC50-Werte im einstelligen Bereich, sogar < 1 µM an der 518A2-Zelllinie, während an den gesunden Gewebszellen keine Aktivität zu verzeichnen war. Neben den Metallkomplexen wurde 37 mit verschiedene Fettsäuren umgesetzt und auf ihre Antitumor-Aktivität getestet.146 Hierbei konnte mit den ungesättigten Derivaten 102a und 102b eine nennenswerte Aktivität an der resistenten KB V1/Vbl-Zelllinie verzeichnet werden. Hervorzuheben ist 102a mit einem IC50-Wert von 5 µM. Zusätzliche Metallkomplexe wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Clemens mittels UV/Vis-Spektroskopie untersucht, um mehr Aufschluss bzgl. der Mobilisierung von Eisen(III) durch die Cumarine Scopoletin (154), Esculetin (155) und Fraxetin (156) zu gewinnen. Anhand der UV/Vis-Spektren und der Massenspektrometrie konnte gezeigt werden, dass das Mobilisieren von Eisen in der Schotenkresse Arabidopsis thaliana nicht entweder nach Strategie I (saure Reduktion von Eisenverbindungen: Fe3+ -> Fe2+) oder II (Chelatisieren von Eisen: Siderophore), sondern nach beiden gleichzeitig verläuft.184 Folglich bildet das von der Pflanze im alkalischen Boden freigesetzte 154 stabile Fe(II)-Komplexe aus Fe2O3, um eine Re-Oxidation des Eisens zu vermeiden. Durch diese Komplexe ist das Eisen jederzeit verfügbar und kann in der Pflanze bis zu seinem Gebrauch gespeichert werden.184 Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der intrazellulären Verteilung von Carboplatin (4), welche mittels Click-Reaktion vonstattengehen sollte. Die Darstellung des alkinmarkierten Carboplatinderivats 158 erfolgte bis zur Stufe des Dibromids 185. Hierzu wurde ausgehend von Dimethylmalonat (176) und Methylchloroformiat (180) der Triester 181 dargestellt, welcher mit Propargylbromid zu Verbindung 182 umgesetzt wurde. Nach anschließender Retro-Claisen-Reaktion zu 183 und Reduzierung zum Diol 184 konnte mittels Mukaiyama Redox-Reaktion das Dibromid 185 gebildet werden.

Abstract in weiterer Sprache

One of the main handicaps in modern cancer therapy includes on the one hand the resistance of tumor cells to apoptosis and on the other hand the toxicity of many drugs against healthy tissue. To counteract these problems coordination complexes should be made by using natural products as ligands, in particular flavonoids and naphthoquinones, and suitable bioactive metal fragments. One of the aims of this work was to synthesise more active and selective cytotoxic agents by the interaction of the two active units, which were subjected to biological tests afterwards. Wogonin (17), chrysin (23), apigenin (12), genistein (13) and xanthohumol (24) and as naphthoquinone ligands juglone (38), plumbagin (37) and its derivatives were used as flavonoide ligands with single coordination site. In collaboration with the research group of Prof. Dr. Rambold Parietin (107) was isolated from lichens and served as a further ligand in the complexation of various metals including copper, iron, platinum, ruthenium, aluminum and gallium. While the complexation of xanthohumol (24) and parietin (107) resulted in insoluble solids or decomposition products the other flavonoids and napthoquinones could partly achieve very good results. The synthesis of the known copper complexes 117, 122 and 126 was carried out partly with slight variations according to Zeng et al. from the ligands 23, 13 and 12.36 Both ligands and copper complexes showed no activity against malignant fibroplast, while the activity on the resistant cell lines (KB-V1/Vbl, MCF-7/Topo) was highest. The IC50 values of the copper(II)-chrysin complex 117 and copper(II)-genistein complex 122, which had a single-digit µM range (4.6 – 8.5) on both resistant cancer cell lines KB-V1/Vbl and MCF-7/Topo have to be pointed out.36 Each of the cell cycle analysis of the three complexes 117, 122 and 126 exhibited a distinct G2/M arrest in comparison to the corresponding ligands 23, 13 and 12.36 By woundhealing assays the migration-inhibiting property of the copper complexes could be determined and 122 showed the greatest effect.36 Additionally, the antimetastatic effect of 13, 122, 12 and 126 was shown by staining the actin cytoskeleton, immunofluorescence staining of cellular beta-catenins and a gelatin zymography assay. In order to compare the influence of various ligands and metal centers with each other the three ligands 23, 13 and 12 were treated with further metal salts. From the metal complexes 118, 119 and 124 only aluminum(III)- 118 and iron(III)-chrysin complex 119 showed a significant activity on the HCT-116 cell line with IC50 values in the range of 8.7 – 12.1 µM. It was planned to apply wogonin (17) as another flavonoid ligand. During the production of 17 the publicized synthesis by Huang et al. could be refuted.27 Only negletein (71) could be obtained. The complexation with Cu(OAc)2 x H2O showed no significant increase in activity in cancer cell lines. Metal complexes of the precursor of 17, chalcone 20, could be obtained with significant IC50 values. Although 20 itself has already a good activity, the copper(II) complex 109 or the iron(III) complex 111 could achieve IC50 values on the 518A2 and HCT-116 cell line in the single-digit range of 3.8 – 7.5 µM. In addition to the flavonoids naphthoquinones were used for the preparation of metal complexes. Ruthenium(II) plumbagin complexes were synthesized starting from the plumbagin hydrazone compounds 135 and 136.71 The ruthenium(II) complexes 137 – 139 reached IC50 values < 4 µM, 137 below 1 µM in the resistant cancer cell line KB-V1/Vbl. Compared to plumbagin (37) the complexes 137 – 139 showed no effect on healthy cells and were still able to increase the activity against malignant cells, which makes them a potential new candidate for cancer chemotherapy. Another plumbagin hydrazone, ferrocene complex 142, showed no harmful effects on normal tissues compared to 37 either and reached an IC50 value of 1.1 µM range in the KB-V1/Vbl cancer cells.71 In addition, an IC50 value of 0.5 µM in the skin cancer cells was observed so 142 showed a greater effect on various cell lines, compared to the complexes 137 – 139. Through the cell cycle analysis it could be shown that the compounds 137 and 142 increase the amount of apoptotic cancer cells in a dose- and time-dependent manner, while 37 induced G2/M arrest on the cell lines HCT-116 and KB-V1/Vbl.71 An important component of the mechanism of action of 37 is the modification of DNA, which is caused amongst others by oxidative damage produced by ROS or by intercalation. The ROS production of 142 is higher compared to 37 starting already at a concentration of 10 µM.71 The derivatives 137 and 142 also caused greater shifts at lower concentrations in EMSA as compared to 37 presenting more extensive morphological changes of the treated linear DNA.71 137 and 142 could achieve an inhibition of the intracellular substrate for P-gp calcein-AM protein to 50% and 80% in comparison to 37, which has no influence on this transporter. This is in line with the resistance of KB-V1/Vbl cell line against 37. Based on 142 ferrocene complex 149 of juglone (38) was synthesized.71 149 has no activity against cancer cell lines. The plumbagin derivative 106 should serve as a further ligand, to which Cu(OAc)2 x H2O was added. The copper(II) complex 150 reached IC50 values on the cell lines HCT-116 and KB-V1/Vbl in the single-digit range and < 1 µM on the 518A2 cell line, whereas the healthy tissue cells showed no activity. In addition to the metal complexes various fatty acids were reacted with 37 and were tested for their antitumor activity.146 In this case the unsaturated derivatives 102a and 102b showed a considerable activity on the resistant KB-V1/Vbl cell line. Especially 102a has to be pointed out with an IC50 value of 5 µM. Other metal complexes were investigated in collaboration with the research group of Prof. Dr. Clemens by UV/vis spectroscopy in order to get more information about the mobilization of iron by the main representatives of coumarins scopoletin (154), esculetin (155) and fraxetin (156). Using UV/vis spectra and mass spectrometry it was shown that the mobilization of iron in the roots of Arabidopsis thaliana does not run either according to strategy I (acidic reduction of iron compounds: Fe3+ -> Fe2+) or II (chelating of iron: siderophore). It runs by using both strategies at the same time.184 Therefore 154, which is released in alkaline soils by the plant, builds stable iron(II) complexes of Fe2O3 in order to avoid re-oxidation of the iron. By these complexes the iron is readily available and can be stored in the plant up to its use.184 An additional part of the thesis was the intracellular distribution of carboplatin (4), which should be proceeded by click reaction. The representation of alkyne labeled carboplatin derivative 158 was carried out to dibromide 185. Starting from dimethyl malonate (176) and methyl chloroformate (180) the triester 181 could be obtained, which was converted to compound 182 with propargyl bromide. After subsequent decarboxylation to 183 and reduction to diol 184, dibromide 185 could be built by Appel reaction.