Identification of novel components of the zinc homeostasis mechanism in Arabidopsis thaliana

Titelangaben

Beyene Chichaibelu, Blen:
Identification of novel components of the zinc homeostasis mechanism in Arabidopsis thaliana.
Bayreuth , 2013 . - VIII, 167, XX S.
( Dissertation, 2013 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Zinc is the second most widely used transition metal in living systems. It is mainly involved in catalytic processes; it has also structural role in different proteins. Besides its widespread use in living systems zinc deficiency is one of the prevalent malnutrition challenges. Current estimates suggest that 31% of the world's population is at risk of zinc deficiency. Exponential population growth and natural resources scarcity might aggravate this problem. Therefore, in an initiative to advance the current understanding of the Zn homeostasis mechanism and aid the biofortification research, a forward genetics approach was adopted to identify molecular components of the Zn homeostasis network in plants. Previous observations have indicated that irregularity in zinc homeostasis mechanism often leads to a reduction in zinc tolerance of plants. Hence, EMS mutagenized second generation seeds of Arabidopsis thaliana were screened for reduced root growth in the presence of zinc stress (i.e. zinc hypersensitive response) in order to identify new elements of the zinc homeostasis mechanism. On the second round of screening conducted in this project 28 new Increased Zinc Sensitivity (IZS) mutants were identified and five of them (i.e. IZS 377, IZS 389, IZS 390, IZS 394 and IZS 479) were further characterized. Among these five newly characterized IZS mutants, only IZS 497 showed a specific zinc hypersensitivity phenotype (i.e. not hypersensitive to other transition metals tested). In IZS 479 a substitution of the 293rd aspartic acid by asparagine was indentified in the MTP1 gene, which could be the reason behind its zinc hypersensitivity phenotype. Furthermore, characterization of IZS 288 (one of the IZS mutants identified in the first round of screening) identified pleiotropic effects of the mutation, such as altered root architecture, changed leaf morphology, early flowering and chilling hypersensitivity, in addition to the zinc hypersensitivity phenotype. Map-based cloning of the mutated gene in IZS 288 lead to the identification of a novel WD-40 gene that is presumed to form a complex with cullin 4 ubiquitin E3 ligases and take part in the selective degradation of substrate proteins via the ubiquitin proteasome pathway. Single putative orthologs of this gene are found in Homo sapiens, D. melanogaster, C. elegans, X. laevis etc. However, functional characterization of most of these genes was still missing; hence a phenotypic analysis of three RNAi lines of the putative Drosophila ortholog was carried out. Observation in this experiment indicated the potential role of this gene at different organs and developmental stages of Drosophila. In IZS 288, the substitution of the 377th threonine by isoleucine (which is in the conserved region of the protein) might have caused a disruption in the protein structure that led to malfunctioning in the cullin 4 ubiquitin E3 ligases complex. Based on microarray analysis potential substrates (i.e. JAZ8, the TTD-A subunit of the basal transcription factor complex (TFIIH) and three histone families) of this complex were indentified. However further experiments will be required to prove the effect of the point mutation on the structure of the protein and its interaction with cullin 4 ubiquitin E3 ligase as well as to verify the potential substrates. Finally, based on prior observation flavonoids were assumed to have a role in heavy metal tolerance of plants; thus, the effect of flavonoids in zinc tolerance of Arabidopsis thaliana plants were investigated using five different flavonoids deficient mutants (i.e. transparent testa (tt) mutants). The mutant line that is completely devoid of flavonoids (tt4) and the one lacking quercetin (tt7) showed strong zinc hypersensitivity. Thus, quercetin appeared to be more effective than kaempferol in shielding the effect of zinc stress in Arabidopsis.

Abstract in weiterer Sprache

Zink ist das zweithäufigste Übergangsmetalle, das in lebenden Systemen Verwendung findet. Es ist hauptsächlich in katalytische Prozesse involviert, hat aber auch in verschiedenen Proteinen eine strukturgebende Funktion. Bei Zink-Defizienz handelt es sich, aufgrund der weitverbreiteten Verwendung in Lebewesen, um eines der häufigsten Mangelernährungs- probleme. Laut aktuellen Schätzungen sind ca. 31% der Weltbevölkerung von Zink-defizienz bedroht. Exponentielles Bevölkerungswachstum und die Verknappung der natürlichen Ressourcen werden dieses Problem höchstwahrscheinlich noch verschärfen. Aus diesem Grund wurde ein genetischer Screen zur Identifizierung molekularer Komponenten des Zinkhomöostase Netzwerkes in pflanzen mit dem Ziel das Verständnis der Zinkhomöostasemechanismen zu verbessern und damit die Forschung im Bereich der Biofortifikation zu unterstützen begonnen. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Deregulationen in der Zinkhomöostase oft zu einer verminderten Zinktoleranz in Pflanzen führen. Aus diesem Grund wurden EMS-mutagenisierte Samen (M2-Generation) von Arabidopsis thaliana auf ein vermindertes Wurzelwachstum hin selektiert, um neue Mechanismen der Zinkhomöostase zu identifizieren. Die zweite Selektionsrunde, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurde, führte zu Identifizierung von 28 neuen Mutanten. Aufgrund der erhöhten Zinksensitivität wurden diese Mutanten als IZS-Mutanten (für increased zinc sensitivity) bezeichnet. Fünf dieser Mutanten (IZS 377, IZS 389, IZS 390, IZS 394 und IZS 479) wurden im Zuge dieser Arbeit näher charakterisiert. Als einzige dieser fünf Mutanten zeigte IZS 479 eine zinkspezifische Hypersensitivität (keine Hypersensitivität gegenüber anderen getesteten Schwermetallen wie z.B. Cadmium). Weiterführende Untersuchungen konnten zeigen, dass in IZS 479 einen Aminosäureaustausch an Position 293 das Gen MTP1 aufweist. An dieser Stelle wurde Asparaginsäure durch Asparagin ersetzt. Dieser Austausch ist wahrscheinlich der Grund für die beobachtete Zinkhypersensitivität. Darüber hinaus führten detaillierte Untersuchungen an der Mutante IZS 288 (diese Mutante wurde im Zuge der ersten Selektionsrunde identifiziert) zu dem Ergebnis, dass neben der erhöhten Zinksensitivität die Mutation auch noch weitere pleiotrope Effekte bedingt. Zu diesen Effekten zählen Veränderungen in Wurzelarchitektur und Blattmorphologie, sowie eine verfrühte Blühinduktion und eine erhöhte Kältesensitivität. Mittels Kartierung konnte eine variation in einem bisher noch nicht charakterisierten WD40-gen gefunden werden, welches wahrscheinlich Komplexe mit Cullin 4 Ubiquitin E3-Ligasen eingeht. Diese Komplexe sind für die selektive Degradation von Substratproteinen mittels Proteasomen und vorhergehender Ubiquitinierung verantwortlich. Einzelne putative Orthologe sind in Homo sapiens, D. melanogaster, C. elegans, X. laevis und anderen Spezies zu finden. Allerdings gibt es für die meisten dieser orthologen Gene keine funktionelle Daten. Auf Grund dieser Tatsache wurde, drei RNAi-Linien von Drosophila untersucht, in denen das orthologe Gen herunterreguliert wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen weisen darauf hin, dass dieses Gen wichtig für die Bildung bestimmter Organe und verschiedene Entwicklungsstadien der Fruchtfliege ist. In der Mutante IZS 288 hat der Austausch der Aminosäure 377 von Threonin zu Isoleucin (in einem konservierten Bereich des Proteins) wahrscheinlich eine Veränderung der Proteinstruktur zur Folge, welche eine korrekte Interaktion mit dem Cullin 4 Ubiquitin E3 Ligase Komplex verhindert. Weiterführende Microarray Analysen führten zur Identifizierung von drei potentiellen Substraten (z.B. JAZ8) dieses Komplexes. Es sind aber weitere Experimente nötig, um den Effekt der Punktmutation auf die Struktur des Proteins sowie die Interaktionseigenschaften zu bestätigen. Darüber hinaus müssen auch die potentiellen Substrate noch experimentell bestätigt werden. Neben der Charakterisierung von IZS Mutanten wurden auch andere Mutanten auf ihre Zink sensitivität hin untersucht, die Beeinträchtigungen bei verschiedenen Schritten der Flavonoid biosynthese haben (tt-Mutanten für transparent testa). Diese Mutanten wurden ausgewählt, da frühere Beobachtungen nahelegten, dass Flavonoide eine Rolle bei der Schwermetalltoleranz von Pflanzen spielen. Die beiden Mutanten, die entweder kein Quercitin (tt7) oder überhaupt keine Flavonoide (tt4) synthetisieren konnten, zeigten eine starke Zink-Hypersensitivität. Daraus läßt sich ableiten, dass Quercitin anscheinend effektiver als Kaempferol darin ist, den Effekt von Zinkstress in Arabidopsis zu vermindern.