Virale Regulatoren der Transkription - Klonierung, Expression und Reinigung von CAEV-Tat, HK022Nun und lambda N(1-53) sowie ihrer Wirtsfaktoren JunbZIP (222-331) und E. coli NusA

Titelangaben

Schwarz, Sabine:
Virale Regulatoren der Transkription - Klonierung, Expression und Reinigung von CAEV-Tat, HK022Nun und lambda N(1-53) sowie ihrer Wirtsfaktoren JunbZIP (222-331) und E. coli NusA.
Bayreuth , 2002
( Dissertation, 2002 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In dieser Arbeit wurden drei virale Regulator-Proteine (CAEV-Tat, HK022 Nun und l N (1-53)) und mehrere ihrer nicht-viralen Bindungspartner kloniert, exprimiert, gereinigt und strukturell charakterisiert. CAEV-Tat (Caprines Arthritis-Enzephalitis-Virus) ist ein Transaktivatorprotein aus einem HIV-verwandten Lentivirus der Ziege. Zur effizienten Expression von CAEV-Tat war es notwendig, einige seltene Codons des tat-Gens gegen die jeweils synonymen, aber in E. coli häufiger verwendeten Codons auszutauschen. Ferner mußte eine in E. coli seltene Arginin-tRNA (argU) koexprimiert werden, um die für NMR-Spektroskopie nötigen Proteinmengen herstellen zu können. Expression und Reinigung von CAEV-Tat mittels Standardverfahren wie Metallionenaffinitätschromatographie über einen Histidinanhang oder die Expression und Reinigung als GST-Fusionsprotein waren nicht erfolgreich. Daher mußte ein individuell auf CAEV-Tat zugeschnittenes Reinigungsprotokoll etabliert werden. Aufgrund seines hohen pIs von 11 konnte CAEV-Tat über Kationenaustauscher-Chromatographie an CM-Sepharose und anschließende Hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt werden. Die Ausbeuten an Protein ließ sich durch Verwenden von Heparin-Sepharose als Kationenaustauscher-Material noch weiter steigern. CAEV-Tat zeigte in CD- und NMR-Spektren typische Charakteristika eines a-helikalen Proteins. Da CAEV-Tat in Konzentrationen über 400 µM aggregierte und daher nicht für weitere NMR-spektroskopische Untersuchungen, die höher Konzentrationen voraussetzen, geeignet war, wurde eine cysteinfreie Mutante von CAEV-Tat kloniert und nach dem für das Wildtyp-Protein etablierten Protokoll gereinigt. Die Mutante erwies sich als weitaus NMR-tauglicher und zeigte keinerlei Aggregationstendenzen bei Konzentrationen von 1 mM. Durch NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, daß Wildtyp-Protein und cysteinfreie Mutante strukturell identisch sind. Somit steht mit der cysteinfreien Mutante ein für weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen geeignetes Konstrukt zur Verfügung. Für das CAEV-Tat homologe Maedi-Visna-Virus-Tat-Protein war eine Interaktion mit der basischen und der Leucin-Zipper-Domäne der beiden zellulären Transkriptionsfaktoren Jun und Fos postuliert worden (Morse et al., 1999). Für spätere Vergleichsstudien mit CAEV-Tat und Jun / Fos zu ermöglichen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit der Beschaffung der entsprechenden Nukleotidsequenzen und der Generierung expressionsfähiger Klone von c-jun, c-fos sowie und fosbZIP bereits wichtige Voraussetzungen für spätere Bindungsstudien mit NMR-Spektroskopie geschaffen. JunbZIP (222-331) konnte bereits erfolgreich als GST-Fusionsprotein exprimiert und über Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose gereinigt werden. Nun aus dem lambdoiden Phagen HK022 fungiert bei einer Superinfektion des Wirts mit dem l-Phagen als Terminator der viralen Genexpression. Um spätere Strukturuntersuchungen an diesem System durchführen zu können, mußte zunächst ein auf die E. coli codon usage optimiertes synthetisches Gen für Nun generiert werden. Hierbei erwies sich die Methode nach Kim (1989) als erfolgreich. HK022 konnte mit Ausbeuten von 70 mg/l Kulturmedium über Kationenaustauscher-Chromatographie mit Heparin-Sepharose gereinigt werden. Erste strukturelle Befunde (CD, HSQC-Spektren, Messung des hydrodynamischen Radius) deuten darauf hin, daß es sich bei Nun um ein Protein mit nur gering ausgeprägter Tertiärstruktur handelt. Ein Fragment (1-53) des Antiterminator-Protein N aus dem Phagen l konnte kloniert und als Fusionsprotein mit Ubiquitin exprimiert werden. Die Reinigung erfolgte über Affinitätschromatographie und einen abschließenden RP-HPLC-Schritt nach der Abspaltung des Ubiquitinanteils. l N-Protein liegt in Lösung unstrukturiert vor. Dieser Befund wurde auch für das N(1-53)-Peptid durch CD-Spektroskopie und die Bestimmung des hydrodynamischen Radius erhalten. Bei der Bindung von 15N-N(1-53) an nutboxB-RNA bildet sich ein Komplex, der höchstwahrscheinlich weitgehend die gleiche Struktur wie der Komplex aus N(1-36) und nutboxB-RNA besitzt. Bei Zugabe des Wirtsfaktors NusA aus E. coli zu diesem binären Komplex kommt es auf Seiten von l N (1-53) zu Veränderungen im HSQC-Spektrum, was auf eine spezifische Interaktion zwischen dem längeren l-Peptid und NusA hindeutet. Hiervon sind vor allem die nicht im Komplex mit nutboxB vorliegenden Reste von l N betroffen. Weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen werden klären, inwieweit die nutboxB-RNA an der Interaktion mit NusA beteiligt ist. Mit der Etablierung eines Reinigungsprotokolls für N(1-53) und für E. coli NusA konnten wichtige Voraussetzungen hierfür bereits erfüllt werden.

Abstract in weiterer Sprache

In the present work three viral regulatory proteins (CAEV-Tat, HK022 Nun and l N (1-53)) were cloned, expressed, purified and structurally characterized. CAEV-Tat (caprine arthritis encephalitis virus) is a transactivator protein from a HIV-related virus from goat. For an efficient expression of CAEV-Tat it was necessary to replace some infrequent codons of the tat gene by the synonymous codons that are more frequently used in E. coli. Additionally, in order to allow the production of sufficient amounts of protein for NMR-spectroscopy, argU, a rare tRNA in E. coli coding for arginine had to be coexpressed. Expression and purification of CAEV-Tat using standard protocols like metal ion affinity chromatography using a his-tagged protein or expression and purification as GST-fused protein did not result in sufficient amounts of pure protein. For that reason an individual purification procedure adapted to the specific properties of CAEV-Tat had to be established. Because of its high pI of 11 CAEV-Tat could be purified by cation-exchange chromatography using CM sepharose followed by a hydrophobic exchange chromatography. The protein yield could be further increased by using heparin sepharose for the cation-exchange-chromatography. CAEV-Tat exhibited CD- and NMR-spectra typical for a-helical proteins. CAEV-Tat showed aggregation at concentrations higher than 400 µM and was thus not suitable for further NMR-spectroscopic studies that require higher protein concentrations. For that reason a cysteine-free mutant of CAEV-Tat was cloned and purified according to the protocol established for the wildtype protein. The mutant proved to be more suitable for NMR-spectroscopic studies since it showed no tendency for aggregation at protein concentrations of 1 mM. NMR-spectroscopy revealed that the wildtype protein and the cysteine-free mutant exhibit an identical structure. Thus, the cysteine-free mutant appears to be a suitable construct for further spectroscopical studies. For maedi visna virus Tat protein, a close homologue of CAEV-Tat, an interaction with the basic and the leucine zipper domain of tha cellular transcription factors Jun and Fos has been postulated (Morse et al., 1999). Verification of this hypothesis for CAEV-Tat using NMR binding studies requires sufficient amounts of c-jun, c-fos, junbZIP and fosbZIP. The corresponding proteins were cloned in the present work and JunbZIP (222-331) could also be expressed successfully as GST-fused protein and purified using a glutathione-sepharose affinity chromatography. Nun protein from the lambdoid phage HK022 acts as a terminator of transcription during superinfection of the host by l phages. In order to perform structural studies of this protein a synthetic gene had to be generated that is adjusted to the optimal codon usage in E. coli using th strategy of Kim (1989). HK022 Nun could be expressed with yields of 70 mg/l medium and purified by cation exchange chromatography using heparin sepharose. Initial spectroscopic studies (CD- and NMR-HSQC-spectra, determination of th hydrodynamic radius) suggests that Nun only exhibits a small amount of tertiary structure. A fragment (1-53) of the antiterminator protein N from the phage l was cloned and expressed as a fusion protein with ubiquitin and was purified by affinity chromatograhpy followed by a RP-HPLC step after cleavage of the ubiquitin moiety. Similar to l N, N(1-53) is also unstructured in solution, as evidenced from CD-spectroscopy and the determination of th hydrodynamic radius. Binding of 15N-labeld N(1-53) to the nutboxB-RNA results in a comlex that is - as suggested by the features of its HSQC-spectrum - highly similar in structure to the complex formed by N(1-36). Addition of the E. coli host factor NusA to this binary compley results in shifts of the l N(1-53) resonances suggesting a specific interaction between this longer l N-peptide and NusA. This effect is mainly observed for those residues that are not involved in complex formation with nutboxB. Subsequent NMR spectroscopic studies will help to anwer the question to which extent nutboxB RNA is involved in the interaction with NusA.