Strukturelle Untersuchung des Antiterminationskomplexes von EIAV

Titelangaben

Ehnert, Marc:
Strukturelle Untersuchung des Antiterminationskomplexes von EIAV.
Bayreuth , 2002
( Dissertation, 2004 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden strukturelle Untersuchungen am Antiterminationskomplex von EIAV durchgeführt. Die Auswertung von Tripleresonanz-NMR-Experimenten ermöglichte die sequentielle Zuordnung der Resonanzen von 13C/15N-markiertem EIAV-Tat. Zum ersten Mal konnten mit Hilfe dieser Zuordnung strukturelle Veränderungen des Proteins bei der Wechselwirkung mit TAR-RNA, Cyclin T1 und dem Inhibitor TF53 auf der Basis einzelner Aminosäuren direkt in einem 15N-1H-HSQC-Spektrum beobachtet werden. Es konnte gezeigt werden, dass das EIAV-Tat-Protein ohne die Beteiligung weiterer Bindungspartner an die TAR-RNA bindet. Bei dieser Bindung erfahren die Core-Domäne (Tyrosin-35 bis Tyrosin-49) und das argininreiche Motiv (ARM; Arginin-55 bis Lysin-63) von EIAV-Tat strukturelle Veränderungen, wobei auch der zwischen diesen beiden Domänen liegende Linker (Leucin-50 bis Leucin-54) betroffen ist. Auf RNA-Ebene deutet die Analyse der Imino-Protonen-Verschiebungen auf strukturelle Veränderungen bei der Tat-Wechselwirkung hin, die sich aber auf den Stamm der RNA nur wenig auswirken, so dass von einer Bindung an die ungepaarten Basen der Loopregion ausgegangen werden kann. Die Untersuchung der Interaktionen von EIAV-Tat mit TF53 – einem Inhibitor der HIV-Tat/TAR-Bindung – ergab, dass dieser auch an das virale Protein aus EIAV bindet und dabei – ähnlich wie die TAR-RNA – strukturelle Veränderungen der Core- und ARM-Region induziert. Die Veränderungen des Tat-Proteins, die bei der TF53-Bindung beobachtet wurden, stimmen mit denen der TAR-Bindung zu einem großen Teil überein; Unterschiede sind nur bei wenigen Resonanzen zu erkennen. Offensichtlich bindet der Inhibitor zwar nicht an alle Aminosäuren, die bei der Wechselwirkung mit TAR-RNA beteiligt sind. Beispielsweise sind die für die TAR-Bindung wichtigen Reste Arginin-55 und Asparagin-58 hier nicht betroffen. TF53 bedingt aber ähnliche strukturelle Veränderungen des Tat-Proteins, so dass die TAR-Bindung gehemmt werden könnte. Die Wechselwirkungen von EIAV-Tat mit dem Wirtsfaktor Cyclin T1 wurden anhand verschiedener Systeme untersucht. Da die Reinigungen von Pferde-Cyclin T1 (eCycT1) und einer His-tagged Form von eCycT1 trotz erfolgreicher Expression beider Proteine in E. coli nicht zu einer ausreichend konzentrierten Lösung führten, wurde die Reinigung einer V29L-Mutante von humanem Cyclin T1 (hCycT1_V29L) mittels Ammoniumsulfat-Fällung und einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) etabliert. Das an EIAV-Tat bindende hCycT1_V29L konnte bis zu 80 µM konzentriert werden. Erste CD- und NMR-spektroskopische Untersuchungen belegen, dass sowohl eCycT1 als auch hCycT1_V29L hauptsächlich a-helikale Strukturelemente besitzen. Es konnte zudem gezeigt werden, dass hCycT1_V29L Wechselwirkungen mit EIAV-Tat über Leucine eingeht. Dabei sind neben einigen bereits in der TAR-Bindung involvierten Resten der Core- und Linker-Region auch die Leucine-74 und 75 beteiligt. Aufgrund der schlechten Löslichkeit der 272 Aminosäuren großen CyclinT1-Proteine wurden zudem Untersuchungen mit verkürzten Cyclin-Varianten durchgeführt, die nur die wichtigen amino- und carboxyterminalen Bereiche von Cyclin T1 – verbunden durch einen FKSG-Linker – enthielten. Das daraus abgeleitete synthetische Peptid Mini_eCyc_45 und das etwas längere in E. coli überexprimierte und über Heparin-Sepharose gereinigte Mini_eCyc_75 zeigen in CD- und 1D-NMR-Spektren keine reguläre Sekundärstruktur. Beide Mini-Cycline gehen mit EIAV-Tat nur geringe Wechselwirkungen ein, die sich lediglich bei der Interaktion mit Mini_eCyc_75 in wenigen Verschiebungen der Seitenketten-Resonanzen im 15N-1H-HSQC beobachten lassen. Eine Verstärkung der zwischen zwei Bindungspartnern auftretenden Wechselwirkungen wurde bei der Untersuchung von ternären Interaktionen zwischen EIAV-Tat, TAR-RNA und Mini_eCyc_45 beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Mini_ eCyc_45 zusätzliche strukturelle Veränderungen der TAR-RNA bewirkt. Anhand der Veränderungen im 15N-1H-HSQC von EIAV-Tat konnte ebenso gezeigt werden, dass sich – ähnlich wie bei der Bindung von hCycT1_V29L an Tat – wahrscheinlich mehrere Leucine an dieser ternären Interaktion beteiligen.

Abstract in weiterer Sprache

In the present work structural investigations of the EIAV antitermination complex were carried out. The analysis of triple resonance NMR experiments led to the sequence assignment of the resonances of 13C/15N-labeled EIAV Tat. Based on this assignment for the first time structural changes of the protein could be observed directly on the level of single amino acids in a 15N-1H-HSQC spectrum when interacting with TAR RNA, cyclin T1 and the inhibitor TF53. It was possible to show that the EIAV Tat protein binds to the TAR RNA without the involvement of any additional binding partner. This binding leads to structural changes of the core domain (tyrosine-35 to tyrosine-49) and the arginine rich motiv (ARM; arginine-55 to lysin-63) of EIAV-Tat, affecting also the linker (leucine-50 to leucine-54) between these two domains. The analysis of the imino proton shifts of the RNA interacting with Tat indicates structural changes which have little effect on the RNA stem region. Therefore, it can be assumed that Tat binds to the unpaired bases of the loop region. The investigation of the interactions of EIAV Tat with TF53 – an inhibitor of the HIV Tat/TAR binding – showed that TF53 also binds to the viral protein from EIAV and induces structural changes of the core and the ARM region – similar to the TAR-RNA. The structural changes of the Tat protein which were observed upon interaction with TF53 are highly similar to the changes found in TAR binding. Only few resonances show differences, revealing that the inhibitor does not bind to all of the amino acids which are involved in the interaction with TAR RNA. For example, the residues arginine-55 and asparagine-58 which are important for the TAR binding are not affected. But overall TF53 leads to similar structural changes of the Tat protein which could indicate that the TAR binding was inhibited. The interactions of EIAV-Tat with the host factor cyclin T1 were investigated with the help of different systems. As the purification of equine cyclin T1 (eCycT1) and a His-tagged eCycT1 did not lead to a sufficiently concentrated solution – despite a successful expression of both proteins in E. coli – the purification of a V29L-mutant of human cyclin T1 (hCycT1_V29L) was established by precipitation with ammoniume sulfate and a hydrophobic interaction chromatography (HIC). The EIAV Tat binding protein hCycT1_V29L was concentrated up to 80 µM. First CD and NMR spectroscopic investigations prove that eCycT1 as well as hCycT1_V29L adopt an overall helical structure. Apart from that it was shown that hCycT1_V29L interacts with EIAV-Tat using leucines. In this process, some of the residues of the core and linker region which show interactions with TAR RNA are involved as well as leucine-74 and 75. Because of the bad solubility of the 272 amino acids sized cyclin T1 proteins, shortened cyclin variants including only the important amino and carboxy terminal regions of cyclin T1 linked by an FKSG-linker were investigated additionally. Both, the synthetic peptide Mini_eCyc_45 deduced by this strategy as well as the longer Mini_eCyc_75 which was overexpressed in E. coli and purified with heparin sepharose, show no regular secondary structure in CD and 1D-NMR spectra. Both mini cyclins interact only weakly with EIAV-Tat. These interactions are only reflected by very few shifts of the side chain resonances in a 15N-1H-HSQC spectrum of Tat bound to Mini_eCyc_75. An increase in the interactions of two binding partners were observed when investigating ternary interactions between EIAV Tat, TAR RNA and Mini_eCyc_45. It was possible to show that the binding of Mini_eCyc_45 induces additional structural changes. With the help of the changes found in the 15N-1H-HSQC spectrum of EIAV Tat it was shown that several leucines are involved in this ternary interaction – similar to the binding of hCycT1_V29L to Tat.