Analysis of alkali-inducible genes of Bacillus subtilis

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Atalla, Akram:
Analysis of alkali-inducible genes of Bacillus subtilis.
Bayreuth , 2003
( Dissertation, 2003 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Using the DNA macroarray technique, it could be shown that more than 80 genes induced after alkali shock (Wiegert et al., 2001). While most of them are under the control of the alternative sigma factor (sigmaW), the remaining genes are under the control of one or more unknown regulator(s). By their signature, two of them kipR and yvdT code for regulatory proteins, while pspA, member of the sigmaW regulon, encodes another potential regulator. In this doctoral work, the genes kipR, yvd and pspA were analyzed. The kipR and yvdT genes code for a transcriptional regulator of the IcIR and TetR/AcrR family while the pspA encode a transcriptional anti-activator in E. coli . In Northern blot analyses, it could be shown that all three genes are induced after alkali shock. The transcription start points of the kipR and yvdT genes were identified by primer extension experiments, and it appeared that the transcription is dependent on a vegetative sigma A-like promoter. To identify genes which are under the negative control of the transcriptional anti-activator PspA, a DNA macroarray experiment was carried out. It turned out that several genes are repressed by a factor of at least three under conditions of PspA overproduction. By using the Far-western blot technique, a protein which might interact with the PspA protein was identified. This protein has a molecular weight approximately 50 kDa. In addition, expression of the pst operon ( pst stay for phosphate-specific transport) was analyzed which is induced after phosphate starvation and after alkaline shock. The genes of this operon are involved in the phosphate transport into the cytoplasma. By Northern-blot experiments, it could be shown that all genes of this operon are alkali-inducible. When the transcriptional start point was determined by primer extension, it turned out to be identical to the one determined under phosphate limitation. This transcription start point is preceded by a typical sigmaA-type promoter. Furthermore, alkali-induction is dependent on the PhoP-PhoR two-component signal transduction system. Phosphate-uptake experiments revealed that the uptake of inorganic phosphate was completely abolished after increasing the external pH value.

Abstract in weiterer Sprache

Mit Hilfe der DNA-Macroarray-Analyse konnte gezeigt werden, dass mehr als 80 Gene nach einem Alkali-Schock induziert werden (Wiegert et al., 2001). Während die meisten dieser Gene unter der Kontrolle des alternativen Sigma-Faktors SigmaW stehen, wird die Expression der anderen Gene von einem oder mehreren unbekannten Regulator(en) kontrolliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Alkali induzierbaren Gene kipR, yvdT und pspA analysiert, die aufgrund ihrer Signatur für Transkriptionsregulatoren codieren und daher in der Regulation anderer Gene beteiligt sein können. Während die Gene kipR und yvdT für einen Transkriptionsregulator der IcIR- und TetR/AcrR-Familie codieren, besitzt das pspA-Gen Ähnlichkeit zu einem Gen eines Anti-Aktivators aus E. coli. In der Northern-Blot-Analyse konnte gezeigt werden, dass alle drei Gene nach Alkalischock induziert werden. An Hand von Primer-Extension-Experimenten wurden die jeweiligen Transkriptionsstartpunkte identifiziert. Upstream von den drei potentiellen Transkriptions-Startpunkten befinden sich DNA-Sequenzen mit Ähnlichkeit zu SigmaA-abgängigen Promotoren. Mit einem DNA-Macroarray-Experiment wurden solche Gene identifiziert, die unter der negativen Kontrolle des potentiellen Anti-Aktivators PspA stehen. Nach artifiziell verstärkter Produktion von PspA wurde die Expression von mehreren Genen mindestens dreifach reduziert. In einem Far-Western-Blot Experiment wurde ein Protein mit einer molaren Masse von etwa 50 kDa identifiziert, welches mit PspA wechselwirkt. In weiteren Experimenten wurde versucht die Frage zu beantworten, warum das pst-Operon (pst steht für phosphate-specific transport) als einziges Mitglied des Pho-Regulons durch Alkali induziert wird. Die Gene dieses Operons codieren für ein Phosphat-Aufnahmesystem unter Phosphat-Mangelbedingungen. Durch Northern-Blot-Experimente konnte gezeigt werden, dass alle Gene dieses Operons Alkali-induzierbar sind. Eine Analyse des potentiellen Transkriptionsstartpunkts mittels eines Primer-Extension-Experiments ergab, dass dieser identisch ist mit dem Startpunkt der unter Bedingungen von Phosphathunger bestimmt worden war. Die Transkription des pst-Operons ist SigmaA-abhängig und steht sowohl bei Phosphathunger als auch bei Alkalischock unter der positiven Kontrolle des PhoP-PhoR Zweikomponentensystems. Phosphataufnahme-Experimente haben gezeigt, dass der Transport von radioaktivem Phosphat unter Alkalischock-Bedingungen drastisch reduziert ist. Dies führt offensichtlich selektiv zur Induktion des pst-Operons, wobei die Beobachtung, dass der aktivierte Response-Regulator eine besonders hohe Affinität für die Bindungsstelle upstream des pst-Promotors hat, hier vermutlich eine besondere Rolle spielt.