Isolation and characterization of the B-type allatostatin gene of Gryllus bimaculatus de Geer (Ensifera, Gryllidae)

Titelangaben

Wang, Junling:
Isolation and characterization of the B-type allatostatin gene of Gryllus bimaculatus de Geer (Ensifera, Gryllidae).
Bayreuth , 2004
( Dissertation, 2004 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

1. Cricket B type allatostatins, which belong to a neuropeptide family sharing the conserved W(X)6Wamide structure, exhibited inhibitory functions on the biosynthesis of juvenile hormones (JH) in vitro in the corpora allata (CA) as well as on ecdysteroid biosynthesis in the ovary of adult crickets (Gryllus bimaculatus). To understand the mechanisms of function of the pleiotropic cricket B type allatostatins, it is necessary to characterize their gene (preprohormone) and study the spatial and temporal expression patterns of the gene. 2. By PCR screening of a random primer cDNA library and by RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), a 535 bp 3´cDNA sequence of the cricket B type allatostatin gene was yielded. This 3´cDNA fragment encodes a putative translation product of 85 amino acids with potential dibasic endoproteolytic cleavage sites, which may allow processing into six peptides including three copies of Grybi-AS B1 (GWQDLNGGWGa) and single copies of Grybi-AS B2 (GWRDLNGGWGa), Grybi-AS B3 (AWRDLSGGWGa), and Grybi-AS B6 (AWNNLGSAWGa), respectively. Three of these deduced peptides were previously isolated from cricket brain extracts by conventional chromatographic techniques and were designated as Grybi-AS B1, Grybi-AS B2, and Grybi-AS B3. The Grybi-AS B6 neuropeptide represents a novel member of the B type allatostatins. 3. The nucleotide sequences encoding the type B allatostatins are high in GC-content and show strong homology. The highest GC-content was found for Grybi-AS B3 with 83.3%. The similarity of the nucleotide sequences encoding Grybi-AS B2 and Grybi-AS B1 is 93.3%, whereas Grybi-AS B2 and B3 share 90% nucleotide identity. 4. By Southern blot analyses, it was proven that the Grybi-AS type B gene is present as a single copy per haploid genome of G. bimaculatus. 5. By RT in situ PCR technique, it could be demonstrated that the Grybi-AS B gene is expressed in various tissues of 1 day old female adult crickets: In the central nervous system the Grybi-AS B gene expression was detected in the brain. In the protocerebrum, strong positive signals were found in the median neurosecretory cells, and to a lesser extent in lateral neurosecretory cells and in neurons. Gene expression was also found in the neurosecretory cells of the deuterocerebrum and the tritocerebrum. Furthermore, Grybi - AS B gene expression was localized in neurosecretory cells of the suboesophageal ganglion (SOG), the thoracic ganglia, and the abdominal ganglia. In the germarium and in primary oocytes of the ovary, Grybi-AS B gene expression was detected as condensed signals in the nuclei, but not in the prefollicular cells or the cytoplasm. With ongoing development of the oocytes, the signals in the nuclei (germinal vesicles) appeared as separated granules with weaker intensity, which finally disappeared, whereas in the follicular cells strong signals became apparent. Grybi-AS B gene expression was also detected in the epithelial cells of the accessory reproductive glands of female crickets. In the caecum and midgut, Grybi-AS B gene expression was found in endocrine secretory and epithelial cells, whereas in the hindgut, positive RT in situ PCR signals were detected in both longitudinal and circular muscles and in the gut epithelial cells. Grybi-AS B gene expression was also found in cells of the fat body and in thoracic (flight) muscles. 6. The results on Grybi-AS B gene expression as obtained by RT in situ PCR were confirmed by RT-PCR and RNA dot blot analyses. The expression of the Grybi-AS B gene in various tissues of adult females varied in an age-dependent manner. In brains of virgin females gene expression increased from the day of emergence until day 8 of adult life. In the ovary of virgin females gene expression showed a maximum at day 4 after ecdysis, whereas in mated females gene expression was high during the first two days and at days 6 to 7, but low inbetween. In caecum and midgut of virgin females gene expression was low during the first 5 days after ecdysis, but peaked at days 6 and 7, whereas in the hindgut gene expression was highest at day 3 of adult life. In the fat body, gene expression showed highest values on day 1 and days 6 to 7 after ecdysis. 7. Gene expression in brain, testes, and accessory reproductive glands of 0 to 3 days old male crickets was also demonstrated by RT-PCR and RNA dot blot analyses.

Abstract in weiterer Sprache

1. Die Allatostatine vom Typ B bilden eine Familie von Neuropeptiden [W(X6)Wamide], die bei Grillen (Gryllus bimaculatus) die Biosynthese von Juvenilhormonen (JH) in vitro in den Corpora allata (CA) hemmen, aber auch die Synthese von Ecdysteroiden (Häutungs-hormonen) in den Ovarien. Um die Funktionen dieser pleiotropen Neuropeptide besser zu verstehen, ist es notwendig, ihr Gen bzw. Präprohormon zu charakterisieren und die räumlichen und zeitlichen Muster der Expression zu studieren. 2. Mittels PCR Screening einer cDNA Bibliothek und RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ist es gelungen, eine 535 Basenpaare lange 3´cDNA-Sequenz des Grillen Typ B Allatostatin-Gens zu erhalten. Dieses 3´cDNA Fragment kodiert für ein 85 Aminosäuren langes Translationsprodukt, das zahlreiche dibasische, endoproteolytische Schnittstellen enthält, welche die Prozessierung von sechs Peptiden ermöglichen: drei Kopien des Neuropeptids Grybi-AS B1 (GWQDLNGGWGa) und je eine Kopie der drei Neuropeptide Grybi-AS B2 (GWRDLNGGWGa), Grybi-AS B3 (AWRDLSGGWGa) und Grybi-AS B6 (AWNNLGSAWGa). Drei dieser Peptide waren in einer früheren Untersuchung unserer Arbeitsgruppe aus methanolischen Gehirnextrakten von Grillen mittels konventioneller chromatographischer Techniken isoliert worden und erhielten die Bezeichnungen Grybi-AS B1, Grybi-AS B2 und Grybi-AS B3. Das Neuropeptid Grybi-AS B6 stellt ein neues Mitglied der Typ B Allatostatin-Familie dar. 3. Die die Typ B Allatostatine kodierenden Nukleotidsequenzen sind ausgesprochen GC-reich und weisen eine hohe Homologie auf. Der höchste GC-Gehalt wurde bei Grybi-AS B3 mit 83,3% gefunden. Grybi-AS B2 und Grybi-AS B1 weisen in ihrer Nukleotidsequenz 93,3% Homologie auf, Grybi-AS B2 und Grybi-AS B3 sind zu 90% identisch. 4. Mittels Southern Blot konnte gezeigt werden, dass das Allatostatin Typ B Gen bei Gryllus bimaculatus in nur einer Kopie pro haploidem Genom vorliegt. 5. Mittels der RT in situ PCR Technik wurde gezeigt, dass das Grybi-AS B Gen in verschiedenen Geweben von 1-Tag alten adulten Grillenweibchen exprimiert wird: Im Protocerebrum des Gehirns wurde ein besonders starkes positives Signal in den medianen neurosekretorischenn Zellen gefunden und etwas geringere Reaktion in den lateralen neurosekretorischen Zellen und in Neuronen. Genexpression fand auch in den neurosekretorischen Zellen des Deuterocerebrums und des Tritocerebrums statt. Weiterhin wurde Genexpression in den neurosekretorischen Zellen des Suboesophagealganglions (SOG), der Thorakalganglien und der Abdominalganglien lokalisiert. Im Germarium und in den primären Oozyten des Ovars wurde Genexpression in Form eines kondensierten Signals in den Zellkernen gefunden, aber nicht im Zytoplasma der Oozyten und in den Präfollikelzellen. Während der Oogenese ändert das Signal im Kern seine Form (getrennte Granulae) und wird schwächer, um schließlich ganz zu verschwinden. Zu diesem Zeitpunkt findet man aber ein starkes Expressionssignal in den reifen Follikelzellen. Grybi-AS B Genexpression wurde auch in den Epithelzellen der akzessorischen Geschlechtsdrüsen nachgewiesen. In den Darmblindsäcken und im Mitteldarm wurde eine starke Genexpression in endokrinen sekretorischen Zellen und Epithelzellen gefunden, wohingegen im Enddarm das RT in situ PCR Signal in Längs- und Ringmuskulatur sowie in den Epithelzellen lokalisiert war. Grybi-AS B Genexpression konnte darüber hinaus in Zellen des Fettkörpers und in der Thorax(Flug-)muskulatur nachgewiesen werden. 6. Die Ergebnisse aus den Genexpressionsstudien mittels RT in situ PCR wurden durch RT-PCR und RNA Dot-blot Analysen bestätigt. Die Expression des Grybi-AS B Gens zeigte in allen untersuchten Geweben von adulten Grillenweibchen einen altersabhängigen Verlauf. Im Gehirn von unbegatteten Weibchen stieg die Genexpression vom Tag der Imaginalhäutung bis zum 8. Tag des Adultlebens kontinuierlich an. In den Ovarien unbegatteter Weibchen zeigte die Genexpression am 4. Tag nach der Adulthäutung ein Maximum, während die Expression im Ovar begatteter Weibchen während der ersten beiden Tage nach der Häutung hoch war, dann abfiel und erst zu den Tagen 6/7 hin wieder anstieg. In den Darmblindsäcken und im Mitteldarm konnte in den ersten fünf Tagen nach der Häutung nur eine geringe Expression festgestellt werden, aber ein Anstieg bei den älteren Tieren (Tage 6/7); im Enddarm war die Expression am 3. Tag nach Ecdysis am höchsten. Im Fettkörper erreichte die Expression am ersten Tag des Adultlebens sowie an den Tagen 6 und 7 Maximalwerte. 7. Auch in verschiedenen Geweben (Gehirn, Hoden, Akzessorische Geschlechtsdrüsen) von 1- bis 3-Tage alten adulten Männchen konnte mittels RT-PCR und RNA Dot-blot Analyse Grybi-AS Typ B Genexpression festgestellt werden.