Bestimmung der Struktur der 15. Domäne des Multidomäneninhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie und Design einer inhibitorisch wirksamen Mutante

Titelangaben

Vitzithum, Klaus:
Bestimmung der Struktur der 15. Domäne des Multidomäneninhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie und Design einer inhibitorisch wirksamen Mutante.
Bayreuth , 2004
( Dissertation, 2004 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur der 15. Domäne des Multidomänen-Inhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie bestimmt, sowie die inhibitorischen Eigenschaften dieser Domäne untersucht. Das Vorläuferprotein LEKTI (lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor) umfasst fünfzehn Domänen, von denen die 2. und 15. Domäne zwar ein typisches Kazalmotiv zeigen, jedoch anstatt der für klassische Kazalvertreter üblichen sechs 12-13 Reste zwischen den ersten beiden Cysteinen aufweisen. Bei der schweren autosomal rezessiven Erbkrankheit Netherton Syndrom werden Mutationen im LEKTI-Gen gefunden, die eine vorzeitige Termination der Translation verursachen und daher nur zu verkürzt gebildetem LEKTI-Protein führen. Da die LEKTI-Domäne 15 bei Patienten mit Netherton Syndrom nicht exprimiert wird, ist diese besonders interessant. Einige Symptome des Netherton Syndroms legen eine Fehlregulierung der Proteinase Tryptase nahe, da diese eine Schlüsselrolle bei Überempfindlichkeitsreaktionen und Asthma einnimmt. Bei einem Sequenzvergleich des bislang einzig bekannten natürlich vorkommenden Tryptase-Inhibitors LDTI (leech derived tryptase inhibitor) mit den LEKTI-Domänen wurde eine signifikante Homologie zwischen Domäne 15 und LDTI insbesondere im Bereich der Bindungsschleife gefunden, weswegen eine regulatorische Funktion von LEKTI gegenüber Tryptase vermutet wird. Nachdem kein natürliches Material zur Verfügung stand, war es zur Gewinnung ausreichender Mengen rekombinanten Proteins, wie es für die Bestimmung der Struktur und der inhibitorischen Wirkung erforderlich ist, notwendig, ein geeignetes Expressions- und Reinigungssystem zu entwickeln. Obwohl es inzwischen einige Hinweise auf eine mögliche Prozessierung von LEKTI gibt, ist die natürliche Proteinsequenz der Domäne 15 noch nicht bekannt. Nach Vergleichen mit Kazalvertretern wurde ein 76 Aminosäuren großes Protein (dom15) hergestellt. Wie die strukturelle Charakterisierung ergab, ist dessen COOH-terminaler Abschnitt nicht strukturiert, weswegen eine COOH-terminal verkürzte Variante (dom15kurz) hergestellt wurde, die auch die Auflösung von Mehrdeutigkeiten bei NOE-Kreuzresonanzen erlaubte. Aus den homonuklearen und 15N-editierten NMR-Spektren wurden 887 (dom15kurz) bzw. 908 (dom15) experimentelle Randbedingungen gewonnen, die die Berechnung einer jeweils hochaufgelösten Struktur mit einem RMSD-Wert von 0,5 Å für die schweren Atome des Proteinrückgrats bzw. von 1,0 Å für alle schweren Atome ermöglichten. Beide Varianten zeigen ein typisches Kazal-Strukturmotiv bestehend aus einem dreisträngigen beta- Faltblatt, einer zentralen alpha-Helix und einer exponierten kanonischen Bindungsschleife. Die gegenüber klassischen Kazalvertretern zusätzlichen Reste zwischen den ersten beiden Cysteinen sind teilweise an der Ausbildung einer weiteren aminoterminalen kurzen Helix und einem hairpin-ähnlichen Motiv beteiligt und so angeordnet, dass der klassische Kazal-Faltungstyp nicht gestört wird. Sowohl die kurze als auch die lange Domäne 15-Variante zeigt eine starke und nicht-temporäre kompetitive Inhibierung von Trypsin und Plasmin bei Werten für die Inhibitionskonstanten im einstelligen nM-Bereich, jedoch keine inhibitorische Wirkung gegenüber Tryptase. Aufgrund des identischen Verhaltens dieser beiden Domäne 15-Varianten gegenüber verschiedenen getesteten Proteinasen ist anzunehmen, dass der COOH-Terminus keinen Einfluss auf die inhibitorische Wirkung der LEKTI-Domäne 15 hat. Außerdem wurde in Anlehnung an LDTI eine Variante der Domäne 15 mit nur einer Aminosäure zwischen den ersten beiden Cysteinen (dom15ldti) hergestellt. Nach oxidativer Rückfaltung zeigte dom15ldti ebenfalls eine starke inhibitorische Wirkung gegenüber Trypsin und Plasmin, wie sie auch für dom15 und dom15kurz beobachtet wurde. Dies deutet auf eine starre Bindungsschleife und ein hoch stabilisiertes Proteingerüst hin. Daher wurde ein Strukturmodell für dom15ldti auf Basis der experimentell bestimmten Struktur von dom15kurz erstellt. Reoxidiertes dom15ldti zeigte eine Inhibierung von Chymotrypsin, Elastase und Subtilisin, während dies weder für dom15 noch für dom15kurz beobachtet wurde. Dies lässt darauf schließen, dass der Bereich zwischen den ersten beiden Cysteinen einen Einfluss darauf hat, welche Proteinase inhibiert wird. Aus Überlagerungen der Strukturen von dom15kurz und der Modellstruktur von dom15ldti mit verschiedenen Proteinase-Inhibitor-Komplexstrukturen kann eine sterische Hinderung als mögliche Ursache für das unterschiedliche inhibitorische Verhalten gegenüber verschiedenen Proteinasen abgeleitet werden. Diese Erkenntnis stellt eine mögliche Grundlage für gezielte Veränderungen einer inhibitorischen Selektivität dar. Außerdem erleichtert die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur der LEKTI-Domäne 15 die Suche nach der immer noch unbekannten Zielproteinase.

Abstract in weiterer Sprache

In the present work the structure of the 15th domain of the multidomain inhibitor LEKTI was determined using NMR spectroscopy, as well as the inhibitory properties of this domain were investigated. The precursor protein LEKTI (lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor) consists of fifteen domains, two of which (domain 2 and 15) showing a typical Kazal-type motif but an aberrant spacing of 12-13 residues between the first two cysteines instead of 6 as found for classical Kazal-type-inhibitors. The severe autosomal recessive disease Netherton Syndrome is linked to mutations in the gene encoding LEKTI generating premature stop codons and thus leading to a truncated LEKTI polypeptide. Therefore, especially the 15th domain of LEKTI is of particular interest as it is never expressed in Netherton Syndrome patients investigated so far. Some symptoms of Netherton Syndrome suggest an association with a misregulation of the proteinase tryptase that is known to act as a key mediator for hypersensitivity reaction and for asthma. A sequence alignment of the only known naturally occurring tryptase inhibitor LDTI with the different LEKTI domains reveals a significant similarity between LDTI and domain 15 of LEKTI, especially for the region of the binding loop. Therefore, a regulatory function of LEKTI towards tryptase activity is expected. For sufficient amounts of protein for structure determination and inhibiting assays an efficient system for the recombinant expression and purification of domain 15 was established, as no naturally derived material was available. Although there are some hints for processing of LEKTI, the naturally processed form of domain 15 and therefore its exact length is still unknown. Based on comparison to known Kazal-type inhibitors, a fragment of 76 amino acid residues was produced (dom15). As structural investigations revealed that the COOH-terminal amino acid residues are unstructured, a COOH-terminally truncated fragment containing 59 amino acid residues (dom15short) was produced to solve NOE-ambiguities. Based on homonuclear and 15N-edited NMR spectra 887 respectively 908 experimental restraints were determined for dom15short and dom15 structure calculations leading to well defined structures with rmsd values for structured regions of 0,5 Å for the backbone and 1,0 Å for all heavy atoms, respectively. Both variants show the typical Kazal-fold with a three stranded beta-sheet, a central alpha-helix and an exposed canonical inhibitory loop. The additional residues in the region between the first and second cysteine are partially involved in an additional short aminoterminal helix and a hairpin-like motif, and are orientated in a way that the classical Kazal-scaffold is not disturbed. The short and the long form of domain 15 both exhibit an efficient and permanent competitive inhibition of trypsin and plasmin with values of the inhibitory constant in the lower of nM-range, but no inhibitory activity against tryptase. Due to the identical behavior of these two forms of domain 15 against various tested proteinases, the COOH-terminus seems to have no effect on inhibitory activity of LEKTI domain 15. In addition, another variant of domain 15 with only one residue between the first two cysteines was constructed in accordance to the tryptase inhibitor LDTI (dom15ldti). After oxidative refolding dom15ldti had the same strong inhibitory effect against trypsin and plasmin as observed for dom15short and dom15, indicating a rigid inhibitory loop and a well stabilized protein scaffold. Therefore, a model structure of the dom15ldti was created on the basis of the experimentally determined structure of dom15short. Reoxidized dom15ldti inhibits chymotrypsin, elastase, and subtilisin while neither dom15short nor dom15 does. Therefore, the region between the first two cysteines seems to have an effect on the selection which proteinases are inhibited. By fitting and overlaying the structure of dom15short and a model structure of dom15ldti on known proteinase-inhibitor-complexes, a sterical hindrance can be deduced as possible reason for the different inhibitory behavior against various proteinases. This knowledge provides a basis for a rational manipulation of the inhibitory selectivity. Also, the knowledge of the three-dimensional structure of the 15th domain of LEKTI and its variants will assist in the search for its hitherto unknown target proteinases.