Fluoreszenzdynamik in organischen Materialien

Titelangaben

Beer, Patrick:
Fluoreszenzdynamik in organischen Materialien.
Bayreuth , 2025 . - VII, 185 S.
( Dissertation, 2025 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil wird eine neue Methode zur Erfassung der spektralen Dynamik in (Einzelmolekül-)Fluoreszenzspektren entwickelt. Die herkömmliche Vorgehensweise hierfür basiert auf dem Auswerten von Serienspektren, welche mithilfe eines Spektrometers und einer Kamera aufgenommen wurden. Bei der hier vorgestellten Methode wird ein Spektrum an einer definierten Stelle in zwei Hälften gespalten und die Fluoreszenzemission in beiden Hälften einzelphotonenempfindlich detektiert. Die Änderung der spektralen Position im Laufe der Zeit kann durch ein vorab aufgenommenes Kalibrationsspektrum des Emitters und dem Verhältnis der Emissionsintensitäten in den beiden spektralen Hälften rekonstruiert werden. Diese Methode wird in einem Proof-of-principle Experiment demonstriert. In einer Monte-Carlo-Simulation wird anschließend gezeigt, dass die neue Methode bei gleicher Zeitauflösung eine rund 1,6-mal bessere spektrale Auflösung bzw. bei gleicher spektraler Auflösung eine etwa 2,3-mal bessere Zeitauflösung erzielen kann, als die herkömmliche Methode mit Spektrometer und Kamera. In einer abschließenden Diskussion wird dargelegt, dass der praktische Nutzen der neu vorgestellten Methode insbesondere aufgrund der strikten Abhängigkeit von dem initial aufgenommenen Kalibrationsspektrum begrenzt ist, weshalb gegebenenfalls die herkömmliche Vorgehensweise zu bevorzugen ist. Im zweiten Teil der Arbeit werden isolierte Lichtsammelkomplexe (SCP) der Grünalge Codium fragile durch polarisations-, zeit- und spektral aufgelöste Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Diese SCP Komplexe haben in einer fremden Vorarbeit eine Abhängigkeit der Fluoreszenzemission von der Anregungswellenlänge gezeigt, welche im Hinblick auf den Lebensraum Gezeitengewässer möglicherweise eine wellenlängenabhängige Lichtschutzreaktion des Photosyntheseapparats darstellen. Aus den Messungen wird zunächst ersichtlich, dass die Fluoreszenz einzelner SCP von mehr als einem Emitter ausgeht, weshalb etwaige Lageänderungen eines emittierenden Dipolmoments sich praktisch nicht in der Polarisation der Emission erkennen lassen. Die bemerkenswerteste Erkenntnis ist jedoch, dass sich bei den SCP Komplexen der vorliegenden Arbeit keine anregungswellenlängenabhängige Emission, so wie in der Vorarbeit, ergibt. Entsprechend dem mehrfachen Austausch mit der Arbeitsgruppe R. Fujii kommt dies durch ein Fehlen des Chlorophylls an der Position 614 und des Carotinoids an der Stelle V1 zustande. Im Gegensatz dazu waren wahrscheinlich beide Pigmente in den SCP Komplexen der Vorarbeit enthalten. Gegebenenfalls ist die anregungswellenlängenabhängige Emission die Konsequenz einer Konformationsänderung welche Quenchingkanäle eröffnet (Lichtschutzreaktion) und deren Zustandekommen demnach kritisch von dem Chlorophyll 614 bzw. dem Carotinoid V1 abhängt. Eine Analyse der strahlenden (kr) und nichtstrahlenden Zerfallsraten (knr) zeigt auf, dass einzelne SCP nichtsdestotrotz oft eine deutliche Dynamik in knr aufweisen, welche kontinuierlich oder auch sprunghaft verläuft, was ein Hinweis auf zusätzliche Quenching-Mechanismen (und ggf. Konformationen) ist. Darüber hinaus zeigen einzelne SCP Komplexe bei 639 nm Anregung oft größere kr als bei 561 nm Anregung (am selben SCP), was darauf hindeutet, dass die Emission von unterschiedlichen Zuständen ausgeht. Dass knr systematisch von der Anregungswellenlänge abhängt, wird hingegen nicht beobachtet, weshalb eine Beteiligung von Quenching-Mechanismen unwahrscheinlich ist.

Abstract in weiterer Sprache

The present thesis is divided into two parts. In part one a new method to record the spectral dynamics in (single molecule) fluorescence is developed. The commonly used approach is based on the evaluation of a series of spectra which are recorded by a spectrometer and a camera. In the newly presented method a spectrum is split into two parts at a definied wavelength and the fluorescene emission in both parts is recorded with single photon sensitive detectors. Changes in the spectral position over time can now be reconstruced from a calibration spectrum that was taken in advance and the ratio of the emission intensities in both spectral parts. This method is demonstrated in a proof-of-principle experiment. Furthermore, a Monte-Carlo simulation is conducted to show that the new method features a roughly 1.6 times better spectral resolution at a given temporal resolution or a 2.3 times better temporal resolution at a given spectral resolution than the common spectrometer/camera detection. A summarizing discussion leads to the conclusion that the practical usability of the newly developed method is rather limited, especially due to the strict dependence of the initially taken calibration spectrum. Therefore the commonly used spectrometer/camera method may still be the preferred approach for many use cases. Part two of this thesis focuses on polarisation-, time- and spectrally resolved fluorescence microscopy on isolated light harvesting complexes (SCP) of the green alga Codium fragile. In a foreign preliminary work, these SCP complexes have shown a dependence of their fluorescence emission on the exciation wavelength. Regarding their habitat in the intertidal zone, this might be a wavelength dependent light protection mechanism of their photosynthetic apparatus. The measurements in the present thesis show, that the fluorescence of single SCP complexes originates from more than one emitter. Therefore, changes in the orientation of one of the emitting dipole moments are practically not recognizable via the polarisation of the emission. However, the most remarkable insight is, that the SCP complexes in the present thesis do not show the excitation dependent emission that was reported earlier in the preliminary work. In close dialogue with the group of R. Fujii, it was concluded that this effect is caused by a missing chlorophyll at the positon 614 and a missing carotenoid at the position V1. In contrast, both aforementioned pigments were probably contained in the SCP complexes of the preliminary work. The excitation wavelength dependent emission might probably be the consequence of a conformational change that enables quenching paths (as a light protection mechanism). The existence of this reaction would thus critically depend on the chlorophyll 614 or the carotenoid V1 respectively. An analysis of the radiative (kr) and non-radiative decay rates (knr) reveals that individual SCP complexes still feature a considerable dynamics in knr. The knr variations can be continuous or with discrete steps and could be an indication of additional quenching mechanisms (and possibly conformations). Additionally, individual SCP complexes often show larger kr rates at 639 nm excitation than they do at 561 nm excitation (same complex), which could mean that the emission originates from different states. A systematic dependence of knr on the exciation wavelength is however not observed, for which reason a involvement of quenching mechnisms upon wavelength change is unlikely.