Visualization, Kinetics, and Thermodynamics of DNA-Protein Interactions

Titelangaben

Schubert, Frank:
Visualization, Kinetics, and Thermodynamics of DNA-Protein Interactions.
Bayreuth , 2005
( Dissertation, 2005 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In this work the two spectroscopic techniques surface plasmon resonance (SPR) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) as well as the imaging technique cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM) were used to gain kinetic, thermodynamic and structural information about DNA–protein interactions. Furthermore, the micrographs obtained by cryo-TEM were compared to AFM images taken in a previous work. The main goal of this work was to investigate the influence of surfaces on DNA–protein interactions, therefore the methods mentioned above were chosen. Both SPR and AFM deal with molecules attached to a surface, whereas FCS and cryo-TEM monitor the molecules in free solution. As a suitable model system the well characterized interaction between the human replication protein A (RPA) and DNA was chosen. The application of SPR and FCS to analysing the binding of RPA to ssDNA yields information about the kinetics and thermodynamics. No modification of the protein is required and biotinylated and fluorescently labelled DNA strands are available from commercial sources. Salt concentration, pH and temperature can be varied over a wide range. To best of our knowledge, FCS has not been used previously to obtain equilibrium constants at different temperatures. In this work it was demonstrated how temperature dependent SPR and FCS measurements can be performed and evaluated to determine thermodynamic data of DNA–protein interactions. Astonishingly, the equilibrium constant KD for the binding of RPA to ssDNA obtained by FCS is larger than the value obtained by SPR by a factor of 20–25, depending on the temperature. Therefore the values found for the Gibbs free energy were different, whereas the values for the reaction enthalpy were nearly the same for the two methods used. There are clear evidences that the difference in KD and therefore in Gibbs free energy measured by the two methods is due to different reaction entropies. In SPR the reaction is restricted to two dimensions due to immobilization of the DNA molecules to the sensor surface, thus the rate constants obtained might not be the true association and dissociation rates. As a main result, the data obtained by SPR differ from the data gained from the free solution experiments. The reason for this is a loss of one degree of freedom, which in turn results in different entropic terms for the surface and the free solution techniques. In contrast, FCS is able to follow complex formation without spatial restrictions. In consequence, the reaction in three dimensions is entropically less favourable than the reaction at the solid-liquid interface. This might be due to differences in the cratic entropy between the two geometries, however, the role of hydration can not be assessed by our experiments. The picture of the DNA–RPA interaction was completed by further FCS measurements using various dsDNA fragments containing damage sites. The binding of RPA to undamaged dsDNA fragments showed a low affinity to dsDNA (approx. 15%), as expected from previous AFM experiments. Since RPA is known to have a high affinity to singlestranded DNA, this finding may be explained by the binding of RPA to unpaired nucleotides at the end of the dsDNA. Comparing the two imaging techniques AFM and cryo-TEM one does not find a strong influence of the surface on the DNA–RPA interaction. The kinks formed by UV-damaged DNA observed in AFM experiments could not be verified by the cryo-TEM experiments. There might be two reasons for this: First, the kinks in the AFM experiments are induced by the mica surface and therefore do not occur in cryo-TEM experiments. Second, the resolution of the TEM is not as good as in AFM, therefore, the kinks can not be seen in the TEM. The question if the DNA is wrapping around the RPA as stated in earlier works can not be answered using cryo-TEM. The resolution of this method is not as good as in AFM. In order to get micrographs with a better resolution one has to perform simple TEM experiments including staining of the molecules. The drawback of this procedure is that the molecules are influenced by the staining chemicals and therefore not in their natural state. In a very last part of this work the mini-chromosome maintenance com-plex was investigated using FCS and cryo-TEM. It was shown that the protein exhibits a medium affinity to ssDNA and dsDNA. The structure of the DNA substrate does not play an important role, the interaction was the same for simple and bubble dsDNA and dsDNA containing a ssDNA tail.

Abstract in weiterer Sprache

In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden spektroskopische Methoden Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) sowie die abbildende Methode cryo-Transmissionselektronenmikroskopie (cryo-TEM) verwendet, um kinetische, thermodynamische und strukturelle Informationen über DNA-Protein-Wechselwirkungen zu gewinnen. Des weiteren wurden die mittels cryo-TEM erhaltenen Bilder mit AFM-Bildern einer früheren Arbeit verglichen. Das Hauptziel dieser Arbeit war, den Einfluss von Oberflächen auf DNA-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, daher wurden die oben genannten Methoden gewählt. SPR und AFM sind oberflächengebundene Techniken, im Gegensatz dazu kann man mit FCS und cryo-TEM die Moleküle in freier Lösung untersuchen. Als Modellsystem wurde die sehr gut charakterisierte Wechselwirkung zwischen dem Replikationsprotein A (RPA) und DNA ausgewählt. Durch die Anwendung von SPR und FCS für die Analyse der Bindung von RPA und ssDNA erhält man Informationen über die Kinetik und Thermodynamik. Das Protein muss nicht modifiziert werden, biotinylierte und fluoreszenzgelabelte DNA ist kommerziell erhältlich. Die Bedingungen, wie z.B. Konzentration, pH-Wert und Temperatur können über einen weiten Bereich variiert werden, wie die in dieser Arbeit durchgeführten Messungen zeigen. Es wurde gezeigt, wie man SPR- und FCS-Untersuchungen bei verschiedenen Temperaturen durchführen und auswerten kann, um kinetische und thermodynamische Daten von DNA-Protein-Wechselwirkungen zu bestimmen. Die mittels FCS bestimmte Gleichgewichtskonstante KD ist überraschenderweise um einen Faktor 20-25 (abhängig von der Temperatur) größer als der mittels SPR erhaltene Wert. Die Werte für die Gibbs-Energie sind für die beiden Methoden unterschiedlich, allerdings finden sich sehr ähnliche Werte für die Reaktionsenthalpie. Der Unterschied, der für KD und daher auch für die Gibbs-Energie für beide Methoden gefunden wird, lässt sich nur durch unterschiedliche Reaktionsentropien erklären. Im SPR-Experiment sind die DNA-Moleküle an eine Oberfläche gebunden, die Reaktion ist auf zwei Dimensionen beschränkt. Somit kann es vorkommen, dass die erhaltenen Geschwindigkeitskonstanten nicht den wahren Werten entsprechen. Als wichtiges Ergebnis findet man, dass die Daten der SPR-Experimente sich deutlich von den Daten der FCS-Messungen unterscheiden. Der Hauptgrund ist im Verlust eines Freiheitsgrades durch die Immobilisierung zu suchen, daher findet man unterschiedliche Entropie-Anteile für die oberflächengebundene und die oberflächenfreie Methode. Im FCS-Experiment kann die Komplexbildung in freier Lösung untersucht werden, d.h. ohne räumliche Begrenzung. Als Konsequenz ist die Reaktion in drei Dimensionen entropisch ungünstiger als die Reaktion an der Flüssig-Fest-Grenzfläche. Möglicherweise ist dies durch unterschiedliche kratische Entropien der beiden Geometrien zu erklären, allerdings kann der Einfluss der Hydratation nicht mit diesen Experimenten bestimmt werden. Das Bild zur DNA-RPA-Wechselwirkung ist durch weitere FCS-Untersuchungen vervollständigt worden, bei denen verschiedene dsDNA-Fragmente mit Schädigungen verwendet wurden. Die Bindung von RPA an ungeschädigte DNA zeigt, dass das Protein nur eine geringe Affinität zu dsDNA hat (ca. 15%), wie es von den AFM-Experimenten bekannt ist. Da RPA eine hohe Affinität zu Einzelstrang-DNA aufweist, kann man diese Beobachtung durch eine Bindung des Proteins an ungepaarte Nukleotide am Ende der DNA erklären. Vergleicht man die beiden abbildenden Methoden AFM und cryo-TEM, findet man keinen starken Einfluss der Oberfläche auf die DNA-RPA-Wechselwirkung. Das Auftreten von Knicken bei UV-geschädigter DNA in den AFM-Experimenten konnten nicht durch cryo-TEM-Untersuchungen bestätigt werden. Dies kann zwei Ursachen haben: Erstens können die Knicke in den AFM-Experimenten durch die Oberfläche hervorgerufen werden. Zweitens ist die Auflösung bei den TEM-Abbildungen nicht so gut wie in den AFM-Abbildungen, so dass die Knicke nicht beobachtbar sind. Die Aussage früherer AFM-Experimente, dass die DNA eine Schleife um das RPA bildet, konnte leider durch cryo-TEM-Messungen nicht bestätigt werden. Die Auflösung dieser Methode ist bei weitem nicht so gut wie in den AFM-Experimenten. Einfache TEM-Messungen könnten helfen, diese Frage zu beantworten, allerdings darf man dabei nicht vergessen, dass die Biomoleküle durch Kontrastfärben mit diversen Chemikalien in ihrer Struktur und daher in ihrer Funktion beeinflusst werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden Untersuchungen mittels FCS und cryo-TEM zum Minichromosome-Maintenance-Protein durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Protein eine Affinität zu Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA besitzt. Die Struktur des DNA-Substrats spielt keine entscheidende Rolle, die Wechselwirkung war ähnlich für einfache dsDNA, Bubble-dsDNA oder dsDNA mit Einzelstrang-Überhängen.