Charakterisierung und Identifikation neuer PR-10-Isoallergene aus Karotte und Hasel sowie ihrer Liganden

Titelangaben

Hendrich, Julian:
Charakterisierung und Identifikation neuer PR-10-Isoallergene aus Karotte und Hasel sowie ihrer Liganden.
Bayreuth , 2025 . - II, VI, 156 S.
( Dissertation, 2025 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Laut dem Robert Koch-Institut sind in Deutschland etwa 15 Mio. Menschen gegen Baumpollen sensibilisiert. Typische Symptome der allergischen Reaktion sind Hautreaktionen, Atemwegs- Beschwerden und in seltenen Fällen Anaphylaxie. Bet v 1 ist das Hauptallergen aus Birkenpollen und gehört zu den sogenannten pathogenesis related (PR)-10-ähnlichen Proteinen. Das natürliche (n)Bet v 1 besteht aus einer Mischung verschiedener Isoallergene und Varianten. Isoallergene weisen untereinander eine Aminosäuresequenzidentität von mindestens 67% und Varianten von mindestens 90% auf. Nach erfolgter Sensibilisierung können strukturell ähnliche Bet v 1-homologe Proteine aus anderen Baumpollen (Hasel, Erle, Buche, etc.) und aus botanisch entfernt verwandten Pflanzen (Karotte, Apfel, Erdbeere, etc.) Kreuzallergien auslösen, da gegen Bet v 1 gerichtete IgE-Antikörper mit strukturell ähnlichen Oberflächenstrukturen, sogenannten Epitopen, auf Bet v 1-homologen Proteinen kreuzreagieren können. Welche Epitope genau für die Allergie und Kreuzallergie verantwortlich sind, ist bis heute nicht vollständig geklärt. In dieser Arbeit wurden die beiden neuen Isoallergene aus der Karotte Dau c 1.0501 und 1.0601, die ebenfalls Bet v 1-homologe Proteine sind, auf mRNA- und Proteinebene identifiziert und rekombinant in E. coli hergestellt und allergologisch untersucht. Sie weisen eine Aminosäuresequenzidentität von 54% bis 87% zu den bekannten Isoallergenen Dau c 1.0101 und Dau c 1.0401 auf und zeigten in immunologischen Tests eine starke Reaktion. Eine nicht-allergene Variante Dau c 1-like reagierte kaum, obwohl ihre Aminosäuresequenz mit den neuen Isoallergenen zu >50% identisch ist. Ein Sequenzvergleich zwischen den Dau c 1-Isoallergenen und dem nicht-allergenen Dau c 1-like offenbarte bereits bekannte, aber auch mögliche neue konformationelle IgE-Epitope, die auch für Kreuzreaktionen mit gegen Bet v 1 gerichtete IgE Antikörper verantwortlich sein könnten. Die Hasel kann nicht nur eine Pollenallergie, sondern auch eine pollenassoziierte Nahrungsmittelallergie beim Verzehr der Nüsse auslösen. Die Allergie wird ebenfalls durch eine Kreuzreaktion von ursprünglich gegen Bet v 1 gerichtete IgE ausgelöst. In dieser Arbeit wurden vier neue Isoallergene Cora 1.0501 – 1.0801 in der Hasel identifiziert. Darüber hinaus wurde die Expression aller Isoallergene (Cor a 1.01 – 1.08) in verschiedenen Geweben der Hasel (Kätzchen, Pollen, weibliche Blüte, unreife und reife Nuss) untersucht. Neben den Isoallergenen Cor a 1.01, 1.03, 1.05, 1.06 und 1.07 konnte erstmals auch das Isoallergen Cor a 1.04 in Pollen nachgewiesen werden. Cor a 1.02 und Cor a 1.08 sind die einzigen Isoallergene, die nicht in Pollen vorkommen. In der weiblichen Blüte, der reifen und unreifen Nuss wurden alle Isoallergene mit sehr unterschiedlichem Expressionslevel nachgewiesen. Die Charakterisierung neuer Isoallergene ist sowohl für die allergologische Diagnostik von Bedeutung. Darüber hinaus liefert die Expressionsanalyse weitere Hinweise auf unterschiedliche Funktionen der Isoallergene in der Pflanze. PR-10 und PR-10-ähnliche Proteine können in ihrer amphiphilen Tasche kleine, strukturell unterschiedliche Moleküle wie z.B. Flavonoide, Steroide oder Cytokinine unspezifisch binden, weshalb u.a. eine Funktion als Transport- oder Speicherprotein vermutet wird. Ihre genaue physiologische Funktion sowie die Bedeutung der gebundenen Liganden im Allergiegeschehen ist nur wenig erforscht. Am Lehrstuhl Biopolymere wurden erstmals physiologische Liganden von Bet v 1, Quercetin-3-O-Sophorosid (Q3OS), und von Cor a 1, Quercetin-3-O-(2”-O-β-D-Glukopyranosyl)-β-D-Galaktopyranosid (Q3O-(Glc)-Gal) aus Birken- bzw. Haselpollen isoliert. Interessanterweise binden Bet v 1.0101 und Cor a 1.0401 spezifisch nur ihren eigenen Liganden, nicht aber den des anderen Proteins. Dabei unterscheiden sich Q3OS und Q3O-(Glc)-Gal nur in der Stereochemie der 4“-Hydroxylgruppe des ersten Zuckers in Form von Glucose oder Galaktose. Um weitere physiologische Liganden zu identifizieren und die Hintergründe für die Spezifität der Bindung zu erforschen, wurde nCor a 1, eine Mischung verschiedener Isoallergene und Liganden, aus Haselpollen gereinigt. Mittels ultra-high-pressure liquid chromatography/ quadrupole-time of flight - tandem mass spectrometry (UHPLC/QTOF-MS/MS) konnten weitere glykosylierte Flavonoide nachgewiesen werden. Neben den bereits bekannten diglykosylierten Flavonoiden Q3OS und Q3O-(Glc)-Gal, wurden die monoglykosylierten Flavonoide Quercetin-3-O-Rhamnosid (Q3OR), Kaempferol-3-O-Rhamnosid (K3OR), Quercetin-3-O-Glykosid (Q3OGlc) und Quercetin-3-O-Galaktosid (Q3OGal) identifiziert. Die Bindung konnte mittels NMR-Spektroskopie und isothermal titration calorimetry (ITC) bestätigt werden. Während monoglykosylierte Flavonoide von allen in Pollen vorkommenden Cor a 1-Isoallergenen gebunden wurden, zeigten diglykosylierte Flavonoide eine höhere Spezifität und wurden ausschließlich von Cor a 1.0401, 1.0601 und 1.0701 gebunden. Aus isotope filtered/edited NOESY-Experimenten wurden erfolgreich Protonenabstandsinformationen zwischen Protein und Ligand gewonnen. Dies ermöglichte erstmals die Berechnung einer Komplexstruktur, sowohl mit einem monoglykosylierten als auch mit einem diglykosylierten Flavonoid mittels docking. Tatsächlich werden monoglykosylierte Flavonoide und diglykosylierte Flavonoide in unterschiedlicher Orientierung in der amphiphilen Tasche gebunden. Während bei monoglykosylierten Flavonoiden der Zuckerrest im Inneren der Bindungstasche und die Quercetineinheit am Eingang der Tasche lokalisiert ist, befindet sich bei den diglykosylierten Flavonoiden die Quercetineinheit tief im Hohlraum und der Zuckerrest am Eingang der Bindetasche. Die Komplexstruktur von Cor a 1.0401/ Q3O-(Glc)-Gal und erste NMR-Experimente zeigten außerdem, dass die Aminosäure Ile31 einen wichtigen Einfluss auf die Bindungsspezifität hat. Vorläufige Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Austausch von Phe31 zu Ile31 bei der Variante Bet v 1.0118 zu einer deutlichen Verschiebung der Spezifität von Q3OS zu Q3O-(Glc)-Gal führt.

Abstract in weiterer Sprache

According to the Robert Koch-Institute, around 15 million people in Germany are sensitised to tree pollen. Typical symptoms of the allergic reaction are skin reactions, respiratory complaints and in rare cases anaphylaxis. Bet v 1 is the main allergen from birch pollen and belongs to the so-called pathogenesis related (PR)-10-like proteins. The natural (n)Bet v 1 consists of a mixture of different isoallergens and variants. Isoallergens have an amino acid sequence identity of at least 67% and variants of at least 90%. After sensitisation, structurally similar Bet v 1-homologous proteins from other tree pollen (hazel, alder, beech, etc.) and from botanically distantly related plants (carrot, apple, strawberry, etc.) can trigger cross-allergies as IgE antibodies directed against Bet v 1 can cross-react with structurally similar surface structures, so-called epitopes, on Bet v 1-homologous proteins. However, it is not yet fully understood, which epitopes are responsible for the allergy and cross-allergy. In this work, the two new isoallergens Dau c 1.0501 and 1.0601 from carrot, which are also Bet v 1-homologous proteins, were identified at the mRNA and protein level and recombinantly expressed in E. coli and analysed allergologically. The two newly identified isoallergens show an amino acid sequence identity of 54% to 87% to the known isoallergens Dau c 1.0101 and Dau c 1.0401 and showed a strong reaction in immunological tests. A non-allergenic variant, called Dau c 1-like, hardly reacted at all, although its amino acid sequence is >50% identical to the new isoallergens. A sequence comparison between the Dau c 1 isoallergens and the non-allergenic Dau c 1-like revealed already known, but also possible new conformational IgE epitopes, which could also be responsible for cross-reactions with IgE antibodies directed against Bet v 1. Hazel not only causes a pollen allergy, but also a pollen-associated food allergy when the nut is consumed. The allergy is also triggered by a cross-reaction of IgE originally directed against Bet v 1. In this work, four new isoallergens Cor a 1.0501 – 1.0801 were identified in hazel. In addition, the expression of all isoallergens (Cor a 1.01 – 1.08) was analysed in different hazel tissues (catkins, pollen, female flower, immature and mature nut). For the first time, the isoallergen Cor a 1.04 could be detected in pollen, in addition to the isoallergens Cor a 1.01, 1.03, 1.05, 1.06 and 1.07. Cor a 1.02 and Cor a 1.08 are the only isoallergens that do not occur in pollen. All isoallergens could be detected in the female flower, the mature and the immature nut, however with different expression levels. The characterisation of new isoallergens is important for allergy diagnostics. In addition, the expression analysis provides further evidence that the isoallergens fulfil different functions in the plant. PR-10 and PR-10-like proteins can non-specifically bind small structurally different molecules such as flavonoids, steroids or cytokinins in their amphiphilic pocket, suggesting a function as transport or storage proteins. Their exact physiological function and the role of the bound ligands in the allergic process are still poorly understood. At the Department of Biopolymers, physiological ligands of Bet v 1, quercetin-3-O-sophoroside (Q3OS), and of Cor a 1, quercetin-3-O-(2"-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (Q3O-(Glc)-Gal) were isolated for the first time from birch and hazel pollen. Interestingly, Bet v 1.0101 and Cor a 1.0401 specifically bind only their own ligand, but not that of the other protein. Q3OS and Q3O-(Glc)-Gal differ only in the stereochemistry of the 4"-hydroxyl group of the first sugar in the form of glucose or galactose. To identify additional physiological ligands and to investigate the specificity of binding, nCor a 1, a mixture of different isoallergens and ligands, was purified from hazel pollen. UHPLC/QTOF-MS/MS, was used to detect other glycosylated flavonoids. In addition to the known diglycosylated flavonoids Q3OS and Q3O-(Glc)-Gal, the monoglycosylated flavonoids quercetin-3-O-rhamnoside (Q3OR), kaempferol-3-O-rhamnoside (K3OR), quercetin-3-O-glycoside (Q3OGlc) and quercetin-3-O-galactoside (Q3OGal) were identified. Binding was confirmed by NMR-spectroscopy and ITC. Monoglycosylated flavonoids were bound by all Cor a 1 isoallergens present in pollen, whereas diglycosylated flavonoids showed a higher specificity and were exclusively bound by Cor a 1.0401, 1.0601 and 1.0701. Proton distance information between protein and ligand was successfully obtained from isotope filtered/edited NOESY experiments. Thus, for the first time, complex structures using a monoglycosylated or a diglycosylated flavonoid could be calculated by docking. In fact, they are bound in different orientations in the amphiphilic pocket. The sugar moiety of monoglycosylated flavonoids is located inside the binding pocket and the quercetin moiety at its entrance, whereas the sugar moiety of the diglycosylated flavonoid is situated at the entrance and the quercetin moiety is located deep within the cavity. The complex structure of Cor a 1.0401/ Q3O-(Glc)-Gal and initial NMR experiments also show that the amino acid Ile31 is important for binding specificity. Preliminary results indicate that the Bet v 1.0118 variant shows a significant shift in specificity from Q3OS to Q3O-(Glc)-Gal when Phe31 is substituted with Ile31.