Analyse der Funktion und Regulation des ECF-Sigmafaktors YlaC aus Bacillus subtilis

Titelangaben

Zellmeier, Stephan:
Analyse der Funktion und Regulation des ECF-Sigmafaktors YlaC aus Bacillus subtilis.
Bayreuth , 2005
( Dissertation, 2006 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Alternative Sigmafaktoren mit extracytoplasmatischer Funktion (ECF-Sigmafaktoren) repräsentieren eine sich kontinuierlich vergrößernde Gruppe an Regulatorproteinen, die an der differentiellen Genexpression in Bakterien beteiligt sind. Obwohl Gene, welche durch diese Regulatorproteine kontrolliert werden, ebenso wie die Regulationsmechanismen noch weitgehend unaufgeklärt sind, scheinen ECF-Sigmafaktoren in Bakterien eine Schlüsselrolle im Bereich der Stressantwort, der Differenzierung und der Pathogenese zu spielen. In dem Gram-positiven Modellorganismus B. subtilis konnten bislang sieben Gene mit Ähnlichkeiten zu ECF-Sigmafaktoren identifiziert werden (sigX, sigW, sigM, sigY, sigV, sigZ und ylaC), wobei hauptsächlich sigX, sigW und sigM im Zentrum durchgeführter Untersuchungen standen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der potentielle ECF-Sigmafaktor YlaC hinsichtlich seiner Funktion und Regulation untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ylaC Teil eines tetracistronischen Operons ist und mit dem Gen seines möglichen Anti-Sigmafaktors kotranskribiert wird. Zusätzlich kodiert das Operon für zwei weitere Membranproteine mit bislang unbekannter Funktion. Obgleich kein spezifischer Stressfaktor identifiziert werden konnte, wurde die positive Regulation des ylaA-Operons durch YlaC eindeutig gezeigt. Die Ergebnisse einer globalen Transkriptionsanalyse deuten darauf hin, dass YlaC ausschließlich sein eigenes Operon reguliert. Durch Primer-Extension konnte der Transkriptionsstartpunkt des ylaA-Operons bestimmt werden. Die ermittelte Promotorsequenz ähnelt bereits identifizierten Promotorsequenzen von ECF-Sigmafaktoren aus B. subtilis. Die für den ylaA-Promotor ermittelte Sequenz konnte vor keinem anderen Ges des B. subtilis-Genoms gefunden werden. Durch Northern-Blots und b-Galaktosidase-Tests mit einem DylaD-Stamm wurde gezeigt, dass YlaD als Anti-Sigmafaktor von YlaC wirkt. Gereinigtes YlaD bindet Zink in äquimolaren Mengen und wird deshalb einer neu-definierten Familie von Zink-bindenden Anti-Sigmafaktoren zugeordnet. YlaD ist ein Membranprotein, dessen C-terminus in der Cytoplasmamembran verankert ist. Nach Überexpression konnte YlaD in Western-Blots nur dann nachgewiesen werden, wenn das yluC-Gen, welches für eine intramembrane Protease kodiert, deletiert war. Eine YluC-Variante mit einer Mutation im aktiven Zentrum war nicht mehr in der Lage, das sW-Regulon aus B. subtilis zu aktivieren. In einer DyluC-Mutante reicherten sich auch verkürzte Formen der SigX und SigM Anti-Sigmafaktoren an, was auf eine generelle Rolle von YluC bzw. von intramembraner Proteolyse bei der Regulation von ECF-Sigmafaktoren in B. subtilis hindeutet. Eine mögliche Funktion der bislang uncharakterisierten Membranproteine YlaA und YlaB bei der Regulation der YlaC-Aktivität wurde durch die Konstruktion von Reporterstämmen, welche verschiedene Kombinationen aller vier Gene des ylaA-Operons enthielten, analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von YlaB einen Einfluss auf die Anti-Sigmafaktor-Aktivität von YlaD hat. Durch Western-Blots war ein stabilisierender Einfluss von YlaB auf YlaD nachweisbar. Eine direkte Interaktion zwischen YlaB und YlaD konnte durch in vitro-Experimente gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YlaD, zusammen mit YlaB und eventuell auch mit YlaA, Teil eines membrangebundenen Proteinkomplexes ist, der YlaD vor dem Abbau durch YluC schützt.

Abstract in weiterer Sprache

Alternative sigma factors of the extracytoplasmic function (ECF) subfamily represent an increasing group of regulatory proteins involved in differential gene expression of bacteria. Although, genes controlled by these regulators and mechanisms of regulation are largely unknown, ECF sigma factors are reported to play key roles in stress responses, differentiation and pathogenesis of bacteria. Seven genes with similarities to ECF sigma factors were identified in the Gram-positive model bacterium B. subtilis (sigX, sigW, sigM, sigY, sigV, sigZ and ylaC), and most studies concentrated on sigX, sigW, and sigM. In the present study, the putative ECF sigma factor YlaC was analysed in detail with respect to its function and regulation. It was shown that ylaC is part of a tetracistronic operon, cotranscribed with the gene of a proposed anti sigma factor (ylaD) and two genes encoding transmembrane proteins of unknown function (ylaA and ylaB). Even though no specific stressor could be identified, positive regulation of the ylaABCD operon through YlaC was clearly demonstrated. Results of global transcriptional analyses using DNA-macroarrays indicated that YlaC regulates exclusively its own operon. The transcriptional start site of the ylaABCD operon was mapped by primer extension analysis. The promoter sequence displayed strong similarities to other ECF sigma factor promoter sites of B. subtilis. The exact sequence could not be found in a reasonable distance to any other gene of B. subtilis. A reporter construct and Northern blot experiments performed with a knockout strain of ylaD revealed anti-sigma factor activity of YlaD. Purified YlaD contains zinc in equimolar amounts and, therefore, belongs to a new family of zinc-binding anti sigma factors. YlaD was proven to be anchored to the cytoplasmic membrane by a transmembrane domain at the direct C-terminal end. When overexpressed in B. subtilis, YlaD could be detected in Western blots only when the yluC gene, encoding a putative intramembrane protease, was knocked out. An active site mutant of YluC was unable to induce the B. subtilis SigW regulon. In a yluC-knockout strain truncated forms of the SigX and SigM anti sigma factors were stabilized in the membrane as well, suggesting a general role for YluC and intramembrane proteolysis in the regulation of ECF sigma factor activity in B. subtilis. To analyse a possible function of the so far uncharacterized proteins YlaA and YlaB in regulating YlaC activity, reporter strains with different combinations of the four genes in the ylaABCD operon were constructed. It was shown that mainly the presence of YlaB is of crucial importance for anti sigma factor activity of YlaD. An influence of YlaB on the stability of YlaD was seen in Western blots, and a direct interaction of YlaB and YlaD could be detected in in vitro experiments. These results point to YlaD being part of a membrane-embedded protein complex together with YlaB and possibly YlaA, where YlaD is protected against degradation by the YluC protease.