Immobilisation von Enzymen auf sphärischen Polyelektrolytbürsten

Titelangaben

Haupt, Björn:
Immobilisation von Enzymen auf sphärischen Polyelektrolytbürsten.
Bayreuth , 2006
( Dissertation, 2005 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In dieser Arbeit wurde die adsorptive Immobilisation von Enzymen auf kolloidalen Partikeln untersucht. Diese Partikel bestehen aus Polystyrolkernen auf denen Polymerketten durch eine grafting from-Technik angeknüpft wurden. Sie werden als sphärische Polyelektrolytbürsten bezeichnet. Die Parameter dieser Partikel lassen sich gezielt über die Synthese einstellen. Durch die hohe Oberflächendichte wird ein so genannter brush erhalten, d.h. eine Schicht von Polymerketten, die fest an eine Oberfläche geknüpft sind und deren benachbarten Ketten sich deutlich überlappen. Der Dissoziationsgrad der geladenen Gruppen ist für annealed brushes, die aus schwachen Polyelektrolyten aufgebaut sind, vom pH-Wert abhängig. Für quenched brushes, deren Ketten aus starken Elektrolyten aufgebaut sind, ist der Dissoziationsgrad unabhängig vom pH-Wert. In Abwesenheit von Fremdsalzionen sind die Gegenionen der Polyelektrolytketten innerhalb des brush gefangen und die Ketten werden durch den resultierenden hohen osmotischen Druck bis fast an ihre Konturlänge gestreckt. Es wird hier von einem osmotic brush gesprochen. Für die hier durchgeführten Adsorptionsexperimente wurden drei verschiedene Enzyme verwendet: Glucoamylase, alpha-D-Glucosidase und beta-D-Glucosidase. Als Triebkraft der Adsorption trotz gleichnamiger Ladung der Trägerpartikel und der Enzyme wurde die counterion release force diskutiert: Die positiv geladenen Bereiche eines überwiegend negativ geladenen Enzyms wechselwirken mit negativ geladenen Ketten eines brush. Das zu adsorbierende Protein besitzt N+ positive und N- negative Ladungen. Durch die Adsorption werden nun je N+ Gegenionen des Enzyms und der Polymerketten frei gesetzt und N- Gegenionen in den brush aufgenommen. Somit werden 2 N+ - N- Gegenionen frei gesetzt und erhöhen die Entropie. Für die Beschreibung der Adsorptionskurven wurde ein Modell entwickelt, das als Grenzfälle die Langmuir-, Langmuir-Freundlich- und Brunnauer-Emmet-Teller-Theorie enthält. Allerdings wurde hier nicht von reversiblen Gleichgewichtszuständen ausgegangen. Die Adsorption von flexiblen Enzymen folgte einem BET-Verlauf. Ein Langmuir-Freundlich Verlauf wurde für globuläre Proteine beobachtet. Die Immobilisation von Glucoamylase lieferte sowohl für ein annealed- als auch für ein quenched brush-System übereinstimmende Ergebnisse. Dies kann mit der im Vergleich zur Adsorption von BSA geringeren Wechselwirkung zwischen Glucoamylase und brush erklärt werden. Die Aktivität der adsorbierten Enzyme wurde untersucht und die Ergebnisse mittels Michaelis-Menten-Kinetik ausgewertet. Diese liefert die Parameter Michaelis-Konstante KM und die Wechselzahl kcat. Als Untersuchungsmethoden standen UV/VIS-Spektroskopie und isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) zur Verfügung. Aktivitätsuntersuchungen von gelösten Enzymen unter gleichen Bedingungen dienten als Vergleich für die immobilisierten Enzyme. Für ein annealed und ein quenched brush-System konnte durch Untersuchungen von adsorbierter Glucoamylase gezeigt werden, dass die KM-Werte der immobiliserten Enzyme sich nicht signifikant im Vergleich zur Michaelis-Konstante des nativen Enzyms ändern. Untersuchungen von alpha- und beta-D-Glucosidase wurden mittels UV/VIS-Spektroskopie und ITC durchgeführt. Es wurde hier ebenfalls ein Erhalt der enzymatischen Aktivität gefunden. Für beta-D-Glucosidase konnte beobachtet werden, dass die KM-Werte mit steigender Beladung sich dem des nativen Enzyms annähern und für höchste Beladungen identisch sind. UV/VIS-Spektroskopie und ITC liefern vergleichbare Daten. ITC eignet sich somit als Untersuchungsmethode für die Enzymaktivität. Die Wechselzahl der immobilisierten Enzyme war in allen Messungen herabgesetzt. Besonders ausgeprägt war dieser Abfall für alpha-D-Glucosidase. Da KM erhalten bleibt und Konformationsuntersuchungen anderer adsorbierter Proteine zeigten, dass Adsorption nicht zu starken Konformationsänderungen führt, kann dieser Aktivitätsverlust nicht durch Störung der Konformation auftreten. Die verringerte Aktivität ist auf zur Vergleichsmessung unterschiedliche Bedingungen zurückzuführen. So ist der pH-Wert innerhalb des brush abgesenkt und die Ionenstärke erhöht. Es herrschen für innerhalb des brush adsorbierte Enzyme veränderte Bedingungen, die sich nach außen hin denen in Lösung angleichen. Enzyme, deren Aktivität für niedrige pH-Werte abgesenkt ist, erniedrigen somit kcat. Alpha-D-Glucosidase ist für pH-Werte kleiner als fünf nicht mehr im verwendeten Test aktiv. Zudem zeigten Untersuchungen, dass kcat abhängig von der Vorbehandlung des Enzyms ist. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch Adsorption von Enzymen eine hohe Beladung sphärischer Polyelektrolytbürsten möglich ist. Durch diese einfache Vorgehensweise konnten mit Enzym beladene Trägerpartikel erhalten werden, die unter Erhalt der KM-Werte enzymatisch aktiv waren. Somit eignen sich sphärische Polyelektrolytbürsten ideal als Trägerpartikel für die Immobilisation von Enzymen.

Abstract in weiterer Sprache

The present work describes the immobilisation of enzymes on colloidal particles by adsorption. The particles consist of polystyrene cores onto which polyelectrolyte chains are attached by grafting-from technique and are referred to as spherical polyelectrolyte brushes. The important parameters of the resulting particles can be adjusted by synthesis. Due to the high grafting density a spherical brush is generated. The term brush denotes a system where the average lateral distances between the polyelectrolyte chains are considerably smaller than their contour length. The degree of dissociation of the charged groups is dependent on the pH value in the case of an annealed brush. If the brush consists of strong electrolytes it is denoted as quenched brush. The degree of dissociation is independent on the pH value. In the absence of added salt the counterions of the polyelectrolyte chains are confined within the brush and the chains are stretched almost to their contour length by a high osmotic pressure. The adsorption experiments were conducted using the enzymes: glucoamylase, alpha-D-glucosidase and beta-D-glucosidase. As driving force for the adsorption despite the fact that the carrier particles as well as the enzymes are charged negatively the counterion release force was discussed. The protein posses’ N+ positive and N- negative charges. Here, the positively charged patches of an overall negatively charged enzyme interact with the negatively charged chains of a brush. During adsorption N+ counterions of the enzyme and N+ counterions of the chains are released but N- counterions are confined into the brush. Therefore, 2 N+ -N- counterions are released resulting in an increase in entropy. A model was developed to describe the adsorption curves. It contains the Langmuir, Langmuir-Freundlich and BET-theory as limiting cases. In contrast to the mentioned theories, an equilibrium state was not assumed. Adsorption of flexible enzymes is described with a BET-like behaviour. Where as the adsorption of globular proteins is described by Langmuir-Freundlich-like behaviour. Immobilisation of glucoamylase provides similar results for an annealed and a quenched brush system. This can be explained by a weaker interaction between glucoamylase and brush compared to the adsorption of BSA. In further research, the activity of the adsorbed enzymes was measured. The results were analysed by Michaelis-Menten kinetics and the parameters Michaelis constant KM and the turnover number kcat were obtained. The studies were conducted using UV/VIS-spectroscopy and isothermal titration calorimetry (ITC). All activity measurements of dissolved enzymes were carried out under the same conditions. The activity measurements of glucoamylase showed that KM values of immobilised enzyme did not change significantly compared to the Michaelis constant of dissolved enzyme for both used carrier systems. These results showed that adsorption is an appropriate immobilisation procedure due to the preserved enzymatic activity. The activity measurements of alpha- und beta-D-glucosidase were conducted with UV/VIS-spectroscopy and ITC. The preservation of the enzymatic activity is observed also for these studies. For beta-D-glucosidase, the KM values converge with increased loading of the particles with the values of the dissolved enzyme. They are identical at highest loadings. The measurements by ITC and UV/VIS-spectroscopy provide comparable data. Hence, in addition to UV/VIS spectroscopy, ITC is also a suitable method for determination of enzymatic activity. The turnover number decreases for all the measurements of immobilised enzyme i.e. the enzyme is converting lesser amounts of substrate per time. The decrease is more pronounced for alpha-D-glucosidase. As KM is preserved and conformational measurements of other adsorbed proteins showed that adsorption did not induce strong conformational changes this loss of activity is not induced by disturbances of the conformation. The decreased activity is caused by different conditions during activity measurements of the immobilised and dissolved enzyme, i.e., the pH value is decreased and ionic strength is increased inside the brush. Therefore, there are different conditions for the immobilised enzymes inside the brush compared to the solution. pH value and ionic strength are converging to the condition of the solution with increasing distance to the core. Enzymes with decreased activity for lower pH-value are decreasing kcat. Alpha-D-glucosidase showed no activity in the used assay for pH value lower than five. Furthermore, investigations showed that kcat is dependent on the pre-treatment of the enzyme. In this present work, it was shown that high amounts of enzymes on spherical polyelectrolyte brushes can be adsorbed. With this easy approach enzymes can be immobilised and remain their activity. Therefore spherical polyelectrolyte brushes are suitable as ideal carrier particles for immobilisation.