Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus der RNA-Helikase YxiN - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer in einzelnen Molekülen

Titelangaben

Theißen, Bettina:
Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus der RNA-Helikase YxiN - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer in einzelnen Molekülen.
Bayreuth , 2006
( Dissertation, 2006 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Aufhebung von RNA-Sekundärstrukturen und RNA-Protein-Wechselwirkungen durch RNA-Helikasen ist für viele zelluläre Prozesse von grundlegender Bedeutung. Die RNA-Helikase YxiN aus Bacillus subtilis ist an der Biogenese der Ribosomen beteiligt. YxiN besitzt neben den beiden konservierten Helikasedomänen eine dritte, RNA-bindenden Domäne, die für die Sequenzspezifität verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurden Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus von YxiN mittels Einzelmolekül-FRET-Experimenten untersucht, um Einblick in den Mechanismus der RNA-Entwindung zu erhalten. Rekombinantes YxiN konnte in nativer Form aus Escherichia coli gereinigt werden. YxiN bindet Adeninnukleotide und zeigt eine feste Bindung von RNA. In gekoppelten spektroskopischen Tests wurde die RNA-abhängige ATP-Hydrolyse beobachtet. Die ATP-abhängige RNA-Entwindung wurde in einem dafür entwickelten fluoreszenzbasierten Test in Polyacrylamidgelen nachgewiesen. Für Einzelmolekül-FRET-Experimente wurde YxiN mit zwei Fluorophoren markiert. Dazu mussten zunächst die zugänglichen Cysteine des Wildtyps durch Serin ersetzt werden. Anschließend wurden Cysteine an potentiell lösungsmittelzugänglichen Positionen eingeführt und durch Reaktion mit Dithionitrobenzoat (DTNB) und Tetramethylrhodamin-Maleimid auf ihre Zugänglichkeit getestet. Die Reaktivität der Cysteine mit farbstoffgekoppeltem Maleimid unterschied sich dabei deutlich von der Reaktivität mit DTNB. Die YxiN-Mutanten mit zugänglichen Cysteinen zeigten ähnliche Stabilität und Aktivität wie der Wildtyp. YxiN-Mutanten mit je einem zugänglichen Cystein in beiden Helikasedomänen wurden mit Alexa488 als Fluoreszenzdonor und Tetramethylrhodamin als Akzeptor markiert. Mit limitierter Proteolyse und anschließender Detektion der Fluoreszenz der Fragmente in Polyacrylamidgelen konnte die Orientierung der Fluorophore in YxiN überprüft werden. In Ensemble-Fluoreszenzspektren von doppelt markiertem YxiN konnten keine Änderungen der FRET-Effizienz bei der Substratbindung detektiert werden. In Einzelmolekül-FRET-Experimenten hingegen konnten zwei verschiedene Zustände mit unterschiedlicher FRET-Effizienz identifiziert werden, die zwei verschiedenen Konformationen entsprechen. Die offene Konformation des freien YxiN bleibt auch in Gegenwart von Nukleotiden erhalten. Die zweite, geschlossene Konformation tritt erst in Gegenwart von RNA auf und wird bei der Bindung von ATP stärker populiert. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird für den Mechanismus der RNA-Entwindung durch YxiN ein erweitertes Destabilisierungsmodell vorgeschlagen. Die C-terminale RNA-Bindungsdomäne positioniert dabei die Helikase sequenzspezifisch auf der RNA. Die beiden Helikasedomänen binden unspezifisch an einzelsträngige RNA oder den Übergang von Einzelstrang zu Doppelstrang in der Umgebung. Dabei schließt sich der Spalt zwischen den Domänen. Die Hydrolyse von ATP oder die anschließende Freisetzung von ADP führt zu der Destabilisierung einiger Basenpaare des RNA-Doppelstranges, so dass ein kurzer RNA-Doppelstrang dissoziieren kann. Einzelmolekül-FRET-Experimente eignen sich also zur Beobachtung von Konformationsänderungen in YxiN und liefern damit Einblick in den Mechanismus der RNA-Helikase. Weiterführende Experimente werden ein detailliertes Verständnis für den Mechanismus der RNA-Entwindung durch YxiN ermöglichen.

Abstract in weiterer Sprache

Dissolving RNA secondary structure and RNA-protein interactions by RNA helicases is of fundamental importance for various cellular processes. The RNA helicase YxiN from Bacillus subtilis is involved in ribosome biogenesis. YxiN consists of two conserved helicase domains and a third RNA-binding domain that confers sequence specifity. In this work conformational changes in the catalytic cycle of YxiN were investigated with single molecule fluorescence resonance energy transfer (FRET) experiments to gain insight into the mechanism of RNA unwinding. YxiN has been purified in its native state as a recombinant protein from Escherichia coli. High affinity for RNA and binding of adenine nucleotides was demonstrated. RNA dependent ATP hydrolysis could be observed in a coupled spectroscopic assay. ATP dependent RNA unwinding was investigated in a newly developed fluorescence based assay in polyacrylamide gels. For single molecule FRET experiments YxiN had to be labelled with two different fluorophores. Therefore, accessible cysteins in the wildtype were replaced by serins. Afterwards cysteins were introduced at potentially accessible positions. Their accessibility was assayed by a reaction with Ellman's reagent (DTNB) and tetramethylrhodamine-maleimide. Reactivity with DTNB and fluorophore coupled maleimid differed greatly. For labelling accessible cysteins were chosen in positions where they did not disturb the stability or activity of YxiN. YxiN mutants with one accessible cystein in each helicase domain were labelled with Alexa488 as fluorescence donor and tetramethylrhodamine as acceptor. Limited proteolysis followed by fluorescence detection in a polyacrylamide gel was used to check the orientation of the fluorophores in the YxiN molecule. In ensemble fluorescence spectra of doubly labelled YxiN, no change in FRET efficiency upon substrate binding could be detected. In contrast, two states with different FRET-efficiency were detected in single molecule experiments, corresponding to two different conformations of YxiN. The open conformation populated in free YxiN is retained upon nucleotide addition. The second, more closed conformation cannot be detected before addition of RNA and shows increased population upon ATP binding. Based on these results a modified destabilisation model for the RNA unwinding by YxiN is proposed. The C-terminal RNA binding domain is used to position YxiN within the RNA. Nonspecific binding of the helicase domains to single stranded RNA or a single strand - double strand junction in the neighbourhood induces closing of the domains. ATP hydrolysis or ADP release causes a destabilisation of a few RNA basepairs that may lead to dissociation of a short RNA duplex. Thus single molecule FRET experiments are well suited for the study of conformational changes in the catalytic cycle of YxiN and provide insight into the mechanism of RNA helicases. Further experiments will enable a detailed understanding of the mechanism of RNA unwinding by YxiN.