Construction of plasmid-based expression and secretion vectors and study of the immobilization of proteins on the surface of Bacillus subtilis cells

Titelangaben

Nguyen, Duc Hoang:
Construction of plasmid-based expression and secretion vectors and study of the immobilization of proteins on the surface of Bacillus subtilis cells.
Bayreuth , 2006
( Dissertation, 2006 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Plasmids are useful tools to study gene expression and their function. However, most of the available plasmids for Bacillus subtilis suffer from structural instability because of their rolling-circle replication mechanism. In this work, stable plasmids have been constructed allowing expression of recombinant proteins in the cytoplasm and their secretion into the culture supernatant. The author has also established an experimental system to immobilize proteins on the cell wall of B. subtilis. The sorting of surface proteins to the cell wall in B. subtilis has been investigated. A first generation of plasmids, the series of plasmid-based expression vectors pHCMCs has been constructed allowing stable intracellular expression of recombinant proteins in B. subtilis cells. These expression vectors are based on the recently described Escherichia coli - B. subtilis shuttle vector pMTLBs72 that uses the theta mode of replication. Three different controlable promoters have been inserted into the shuttle vector: PgsiB that can be induced by heat, acid shock, and by ethanol, and PxylA and Pspac that respond to the addition of xylose and IPTG, respectively. The versatility of these expression vectors was demonstrated by fusing their promoters to a reporter gene and by overexpression the gene of the HtpG (a heat shock protein) protein with three of them. All recombinant vectors exhibited full structural stability. A second generation of plasmids, two plasmid-based expression vectors have been constructed, where one plasmid allows intracellular production of recombinant proteins while the second directs the proteins into the culture medium. Both vectors use the strong promoter preceding the groESL operon (codes for the essential heat shock proteins GroES and GroEL) of B. subtilis fused to the lac operator allowing their induction by addition of IPTG. While the background level of expression of these expression cassettes was very low in the absence of the inducer, an induction factor of about 1300 was measured. When the genes htpG and pbpE (coding for a penicillin-binding protein) were fused to the groE promoter, the amount of recombinant protein produced after addition of IPTG represented 10 and 13%, respectively, of the total cellular protein. To obtain secretion of recombinant proteins, the coding region for the signal peptide of the amyQ gene encoding the amylase from Bacillus amyloliquefaciens was fused to the groE promoter. High-level secretion of amyQ amylase and cellulase A and B of Clostridium thermocellum was demonstrated. Gram-positive bacteria code for one or more enzymes termed sortases that catalyze the covalent anchoring of substrate proteins on their cell wall. They recognize an amino acid sequence designated sorting motif, present close to the C-terminal end of the substrate proteins, cleave within this motif, and catalyze anchoring of the polypeptide chain to the peptide crossbridge linking the peptidoglycan strands in a transpeptidation reaction. B. subtilis has been reported to code for two putative sortases, YhcS and YwpE, but the sorting sequences recognized by them are yet unknown. To be able to immobilize proteins on the surface of B. subtilis cells, the srtA gene coding for sortase A of Listeria monocytogenes that recognizes a known sorting motif was introduced into B. subtilis. L. monocytogenes and B. subtilis share the same peptide crossbridge. Next, the coding region of the amylase gene was fused to the C-terminal region of Staphylococcus aureus fibronectin binding protein B (FnBPB) containing the sorting sequence including its sorting motif (LPETG). Covalent linkage could be proven by treatment of the cells with lysozyme and by immunofluorescence microscopy. Up to 240,000 molecules of amylase could be immobilized per cell, 24 times more than previously reported for other bacterial species. To study the influence of the distance between the sorting motif and the C-terminus of the amylase (AmyQ) on the activity of the enzyme, the length of the spacer was varied. It turned out that the highest activity was measured with a spacer length of 123 aa residues. To elucidate whether the putative sortases YhcS and YwpE of B. subtilis can retain the two potential substrates of the sortase YfkN and YhcR, the yhcS and/or ywpE knockout strains were constructed and the translational fusions between AmyQ and N-terminal of YfkN or YhcR, both harbouring the 123-aa spacers, were generated resulting in AmyQ-YfkN123 and AmyQ-YhcR123, respectively. The results demonstrated that YhcS could retain the fusion AmyQ-YhcR123 on the cell wall and YwpE seems to assist YhcS to perform its functions. YhcS could recognize the sequence containing the sorting motif LPDTS from YhcR but not LPETG from FnBPB. YhcR could be a substrate of YhcS, while it is not clear whether YfkN is a cell wall protein. A model for the covalent anchoring of proteins on the cell wall by sortases is presented.

Abstract in weiterer Sprache

Plasmide sind wichtige Werkzeuge, um die Expression von Genen und ihre Funktion zu untersuchen. Die meisten der bei Bacillus subtilis eingesetzten Plasmide zeigen allerdings strukturelle Instabilitaet als Folge ihres Rolling-circle Replikationsmechanismus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden stabile Plasmide konstruiert, die eine Expression rekombinanter Proteine im Cytoplasma und ihre Sekretion in den Kulturueberstand erlauben. Weiterhin wurde ein experimentelles System etabliert, welches die Immobilisierung von Proteinen in der Zellwand ermoeglicht. Außerdem wurde die Verankerung von B. subtilis-Proteinen in der Zellwand untersucht. Eine erste Generation von Plasmiden, die pHCMC-Serie von Expressions-Vektoren, wurde konstruiert, die eine stabile intrazellulaere Expression rekombinanter Proteine in B. subtilis-Zellen erlauben. Diese Expressions-Vektoren basieren auf dem kuerzlich beschriebenen Escherichia coli - B. subtilis Shuttle-Vektor pMTLBs72, der den Theta-Replikations-Mechanismus nutzt. Drei verschiedene kontrollierbare Promotoren wurden in diesen Vektor eingebaut: PgsiB, der durch Hitze, Saeureschock und Ethanol induziert werden kann, und PxylA und Pspac, die durch Zugabe von Xylose bzw. IPTG aktiviert werden koennen. Die Anwendbarkeit dieser Expressions-Vektoren wurde durch die Fusion ihrer Promotoren an ein Reportergen und die UEberproduction von HtpG, einem Hitzeschockprotein, nachgewiesen. Alle rekombinanten Vektoren zeigen volle strukturelle Stabilitaet. Eine zweite Generation von Plasmiden, zwei weitere Expressions-Vektoren, wurden konstruiert. Waehrend eines dieser beiden Plasmide die intrazellulaere Produktion von rekombinanten Proteinen erlaubt, veranlasst das zweite ihre Sekretion ins Kulturmedium. Beide Vektoren nutzen den starken Promotor, der fuer die Expression des groESL-Operons (codiert fuer die essentiellen Hitzeschock-Proteine GroES und GroEL) von B. subtilis verantwortlich ist, fusioniert an den IPTG-induzierbaren lac-Operator (Pgrac). Waehrend der Background-Level in Abwesenheit des Induktors sehr gering war, wurde nach Zugabe von IPTG ein Induktionsfaktor von etwa 1300 gemessen. Nach Fusion der Gene htpG und pbpE (codiert fuer ein Penicillin-Bindeprotein) an den groE-Promotor und ihrer Induktion mit IPTG betrug die Menge an rekombinantem Protein 10 bzw. 13% des Gesamtproteins. Um eine Sekretion der rekombinanten Proteine zu erreichen, wurde die codierende Region fuer das Signalpeptid des amyQ-Gens von Bacillus amyloliquefaciens, welches fuer eine Amylase codiert, an den groE-Promotor fusioniert. Mit diesem Vektor wurde die Sekretion großer Mengen an Amylase und Cellulase A und B von Clostridium thermocellum nachgewiesen. Gram-positive Bakterien codieren fuer ein oder mehrere Enzyme, die als Sortasen bezeichnet werden, und die die kovalente Verankerung von Substratproteinen in der Zellwand katalysieren. Sie erkennen eine Aminosaeuresequenz, Sorting-Motiv genannt, welche nahe dem C-terminalen Ende der Substratproteine gelegen ist, spalten innerhalb des Motivs und katalysieren die Verankerung der Polypeptidkette an der Peptidbruecke, die die Glycanstraenge verbindet, in einer Transpeptidierungsreaktion. Fuer B. subtilis wurden zwei potentielle Sortasen beschrieben, YhcS und YwpE genannt, aber die von ihnen erkannten Sorting-Motive sind unbekannt. Um Proteine auf der Oberflaeche von B. subtilis-Zellen verankern zu koennen, wurde das srtA-Gen aus Listeria monocytogenes, welches ein bekanntes Sorting-Motiv erkennt, in B. subtilis kloniert. L. monocytogenes und B. subtilis enthalten identische Peptidbruecken. Im naechsten Schritt wurde das Amylasegen an die C-terminale Region des Fibronectin-Bindeproteins B (FnBPB) aus Staphylococcus aureus fusioniert. Dieses Protein enthaelt eine Sorting-Sequenz mit dem Sorting-Motiv LPETG. Eine kovalente Bindung der Amylase an die Zellwand konnte durch Lysozym-Behandlung der Zellen und mittels Immunofluoreszenz-Mikroskopie nachgewiesen werden. Bis zu 240000 Amylase Molekuele konnten pro Zelle immobilisiert werden, 24-mal mehr als bislang fuer andere Bakterien-Spezies publiziert. Um den Einfluss des Abstandes zwischen dem Sorting-Motiv und dem C-Terminus der Amylase auf die Enzymaktivitaet zu untersuchen, wurde die Laenge des Spacers variiert. Die hoechste Aktivitaet wurde mit einer Spacer-Laenge von 123 Aminosaeureresten gemessen. Um herauszufinden, ob die beiden potentiellen Sortasen YhcS und YwpE von B. subtilis die beiden Substrate YfkN und YhcR in der Zellwand verankern koennen, wurden Knockout-Staemme konstruiert (yfkN, yhcR und eine Doppelknockout). In diese wurden Translations-Fusionen zwischen AmyQ und dem C-terminalen Ende von YfkN und YhcR mit einer Spacer-Region von 123 Aminosaeureresten einkloniert. Eine anschließende Analyse der Staemme zeigte, dass YhcS AmyQ-YhcR123 an der Zellwand verankern kann und YwpE die Ausbeute erhoeht. YhcS konnte das Sorting-Motiv LPDTS von YhcR erkennen, nicht aber LPETG von FnBPB. Daher koennte YhcR ein Substrat von YhcS sein. Ein Modell fuer die kovalente Verankerung von Proteinen in der Zellwand durch Sortasen wird praesentiert.