Untersuchungen der Speicherlipidbildung in Mikroalgen und in situ Bestimmung durch Fluoreszenzspektroskopie

Titelangaben

Kettner, Alexander:
Untersuchungen der Speicherlipidbildung in Mikroalgen und in situ Bestimmung durch Fluoreszenzspektroskopie.
Bayreuth , 2024 . - XX, 179 S.
( Dissertation, 2024 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Speicherlipide (SL) aus Mikroalgen, zu denen die Stoffgruppen der Triacylglycerole (TAGs) und Polyhydroxyalkanoate (PHAs) zählen, sind eine umweltfreundliche und nachhaltige Alternative zu erdölbasierenden Produkten. Unter ungünstigen Umweltbedingungen werden diese Kohlenstoff- und Energiespeichersubstanzen intrazellulär in Kompartiment-ähnlichen Strukturen akkumuliert. Der abundanteste Vertreter der PHAs ist Polyhydroxybutyrat (PHB). Die Herausforderungen für eine wirtschaftlich rentable industrielle Produktion von PHB liegen in der Identifikation geeigneter Organismen sowie der Analyse und Optimierung des Bildungsprozesses für eine erfolgreiche Skalierung. Zudem ist ein zeitnahes Monitoring der Biomasse- und Produktbildung zur Identifizierung geeigneter Erntezeitpunkte von großer Bedeutung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, einerseits den Prozess der PHB- Bildung in der filamentösen Mikroalge Leptolyngbya sp. NIVA-CYA 255 zu untersuchen und andererseits eine fluoreszenzspektroskopische Methode zur Detektion von bakteriellem PHB in Cupriavidus necator zu entwickeln und auf PHB- und TAG-synthetisierende Mikroalgen zu übertragen. Im Rahmen der Untersuchungen konnte das Schlüsselgen phaCIII der bakteriellen PHB-Bildung identifiziert und mittels PCR in Leptolyngbya sp. NIVA-CYA 255 nachgewiesen werden. Durch die Analyse und Optimierung abiotischer und biotischer Variablen mithilfe von Metadatenanalysen und statistischer Versuchsplanung konnte gezeigt werden, dass Stickstoff- Mangel eine grundlegende Voraussetzung für eine erhöhte PHB-Bildung darstellte. Mixotrophe Mangelkultivierung katalysierte dabei die PHB-Bildung, woraus eine dreistufige Kultivierungsstrategie resultierte. Durch die Bestimmung und Charakterisierung des extrahierten Produkts konnte die PHB-Bildung weiterhin bestätigt werden. Dementsprechend ist Leptolyngbya sp. NIVA-CYA 255 aufgrund der hohen PHB-Produktionskapazität eine geeignete Mikroalge für die technische Herstellung von PHB in Photobioreaktoren. Für die zeitnahe Bestimmung der SL-Konzentration wurde Fluoreszenzspektroskopie eingesetzt. Um die Eignung von LipidGreen2 (LG2) als Fluoreszenzfarbstoff zu prüfen, wurden die spektralen Eigenschaften, die Stabilität und die Quantenausbeute bestimmt. Anschließend erfolgte die Optimierung des Färbeprozesses im Vergleich zu den Farbstoffen BODIPY493/503 und Nile red. LG2 erwies sich als geeigneter Farbstoff zur Visualisierung und Detektion von PHB in C. necator. Der Farbstoff zeichnete sich durch eine hohe Stabilität, polaritäts-empfindlichen Verhalten (Solvatochromie) und keine konzentrationsbedingten Anomalien aus. Die Konstellation aus biotischen und abiotischen Faktoren wirkten dabei auf die Inkubationszeit zwischen Fluoreszenzfarbstoff und der Probe ein. Als bedeutendste Variablen konnte die Biomassekonzentration und Farbstoffkonzentration identifiziert werden. Durch die Einbeziehung des Seitwärtsstreulichtes (SSC) wurden die Auswirkungen der Biomasse auf das Messsystem berücksichtigt, wodurch sich hohe lineare Zusammenhänge der Fluoreszenz zu den analytischen Referenzwerten ergaben. Unter Nutzung von Modell- gestützten Analysen konnten anschließend die analytischen Werte mit hoher Genauigkeit für N-Mangel, Pi-Mangel und NaCl-gestressten Kulturen wiedergegeben und vorhergesagt werden. Im Anschluss wurde die Methode zur Bestimmung von PHB in Leptolyngbya sp. NIVA-CYA 255 sowie von Lipid/TAG in den eukaryotischen Mikroalgen Stichococcus sp. WB02, Porphyridium purpureum und Nannochloropsis salina eingesetzt. Die Verwendung von SSC und Fluoreszenz war unabhängig von SL-Art und Organismus möglich. Das Modell der linearen Regression wurde dabei erfolgreich zur Bestimmung der Biomasse- und SL- Konzentration angewandt. Zudem waren Klassifizierungsmodelle in der Lage, den Solvatochromie-bedingten Effekt von LG2 zu nutzen, um anhand der Fluoreszenzdaten zwischen PHB und Lipid/TAG zu unterscheiden. Die Kombination aus statistischer Versuchsplanung und datenwissenschaftlicher Auswertung der Ergebnisse erwies sich als eine effiziente Strategie zur Identifizierung von Einflussfaktoren und Optimierung von Zielgrößen. Die erstellte Fluoreszenzmethode in Verknüpfung mit Modell-gestützter Analysen zeigte eine hohe Wiedergabegenauigkeit der Biomasse- und der SL-Konzentration. Die entwickelte Methodik erwies sich als selektiv und übertragbar. Ein entscheidender Vorteil der fluoreszenzspektroskopischen Methode ist die deutlich reduzierte Zeit, die im Vergleich zu chromatographischen Methoden wie der HPLC benötigt wird. Während die spektroskopischen Messungen nur 6-7 min inklusive der Probenvorbereitung dauern, benötigt die HPLC-Analyse 2-3 Stunden, ohne die notwendige Trocknung der Probe zu berücksichtigen. Diese Zeitersparnis qualifiziert die fluoreszenzspektroskopische, neben der geringeren Investitionskosten, als eine effiziente Methode für eine online-Bestimmung von PHB und TAG in Mikroorganismen. Die vorliegenden Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, die angewandte Methode zur Identifizierung weiterer relevanter Variablen zu erweitern. Ein Beispiel dafür ist das Pigment Phycocyanin, das kommerziell als Lebensmittelfarbstoff eingesetzt wird. Die entwickelte Methode bietet somit eine Basis für die Entwicklung eines flexiblen und dezentralen Monitorings von Zielvariablen in Mikroalgen durch at-line-Monitoring.

Abstract in weiterer Sprache

Storage lipids (SL) from microalgae, including the substance groups of triacylglycerols (TAGs) and polyhydroxyalkanoates (PHAs), are an environmentally friendly and sustainable alternative to petroleum-based products. Under adverse environmental conditions, these carbon and energy storage substances are accumulated intracellularly in compartment-like structures. The most abundant representative of PHAs is polyhydroxybutyrate (PHB). The challenges for economically viable industrial production of PHB lie in the identification of suitable organisms and the analysis and optimization of the formation process for successful scaling. Furthermore, timely monitoring of biomass and product formation to identify suitable harvesting times is of great importance. The aim of this work was to investigate the process of PHB formation in the filamentous microalga Leptolyngbya sp. NIVA-CYA 255, and to develop a fluorescence spectroscopic method for detecting bacterial PHB in Cupriavidus necator and to apply this method for the detection of PHB- and TAG in microalgae. In the course of the investigations, the key gene phaCIII for bacterial PHB formation was identified and detected in Leptolyngbya sp. NIVA-CYA 255 using PCR. By analyzing and optimizing abiotic and biotic variables with metadata analyses and statistical experimental design, it was shown that nitrogen deficiency is a fundamental requirement for increased PHB formation. Mixotrophic deficiency culture conditions catalyzed PHB formation, resulting in a three-stage culturing strategy. The determination and characterization of the extracted product further confirmed PHB formation. Accordingly, Leptolyngbya sp. NIVA-CYA 255 is a suitable microalgae for the technical production of PHB in photobioreactors due to its high PHB production capacity. For the timely determination of SL concentration, fluorescence spectroscopy was used. To test the suitability of LipidGreen2 (LG2) as a fluorescence dye, its spectral properties, stability, and quantum yield were determined. Subsequently, the staining process was optimized in comparison to the dyes BODIPY493/503 and Nile red. LG2 proved to be a suitable dye for visualizing and detecting PHB in C. necator. The dye was characterized by high stability, polarity-sensitive behavior (solvatochromism), and no concentration-related anomalies. The constellation of biotic and abiotic factors affected the incubation time between the fluorescence dye and the sample. Biomass concentration and dye concentration were identified as the most significant variables. By incorporating the sample`s side scatter (SSC), the effects of biomass on the measurement system were considered, resulting in high linear correlations of fluorescence to the analytical reference values. Subsequent model-based analyses were able to accurately reproduce and predict during N-deficiency, Pi-deficiency, and NaCl-stressed cultures. The method was afterwards applied to determine PHB in Leptolyngbya sp. NIVA-CYA 255 and Lipid/TAG in the eukaryotic microalgae Stichococcus sp. WB02, Porphyridium purpureum, and Nannochloropsis salina. The use of SSC and fluorescence was independent of SL type and organism. The linear regression model was successfully used to determine biomass and SL concentration. Furthermore, classification models were able to use the solvatochromism effect of LG2 to distinguish between PHB and Lipid/TAG based on fluorescence data. The combination of statistical experimental design and applied data scientific evaluation proved to be an efficient strategy for identifying influencing factors and optimizing target variables. The developed fluorescence method in conjunction with model-based analyses showed high accuracy in reproducing biomass and SL concentration in the tested organisms. The developed methodology proved to be selective and transferable. A crucial advantage of the fluorescence spectroscopic method is the significantly reduced time required compared to instrumental analytics like HPLC. While the spectroscopic measurements take only 6-7 min including sample preparation sample, HPLC analysis requires 2-3 h without considering the necessary sample drying. This time saving makes the fluorescence spectroscopic method efficient and cost-effective for a timley investigation of PHB and TAG in microorganisms. The present results open up the possibility to extend the applied method for the identification of further relevant variables. An example of this is the pigment phycocyanin, which is commercially used as a food coloring agent. The method thus offers new perspectives for the development of a flexible and decentralized monitoring of target variables in microalgae by at- line-monitoring.