Biochemical analysis of the interaction between transfer ribonucleic acid and exportin-t

Titelangaben

Li, Sheng:
Biochemical analysis of the interaction between transfer ribonucleic acid and exportin-t.
Bayreuth , 2006
( Dissertation, 2006 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In this thesis the ternary complex of tRNA•exportin-t•Ran•GTP was studied by biochemical and biophysical methods. Firstly, photocrosslinking was used to determine the contact sites between tRNA and exportin-t. 4-Thiouridine (s4U) was introduced into tRNAPheT.th by in vitro transcription with T7 RNA polymerase and crosslinked to exportin-t by irradiation at 312 nm. The crosslinking was Ran•GTP dependent and could be competitively inhibited by other tRNA species, showing that the crosslinking was the consequence of the formation of a tRNA•exportin-t•Ran•GTP complex. The crosslinked complex of (s4U)tRNAPheT.th-exportin-t after proteinase K digestion was incubated with a primer complementary to the 3'end of the tRNAPheT.th in the primer extension reaction. The elongation of the reverse transcriptase was forced to halt at s4Us crosslinked to peptides, namely, U55, U47, U33, U20. Among them, U47 and U55 were shown to be the major crosslinking sites. U47A mutation was introduced into tRNAPheT.th to test the role of U47. The mutant tRNAPheT.th transcript was still able to bind exportin-t, though a little weaker than normal tRNAPheT.th transcript. In contrast, s4U containing mutant tRNAPheT.th U47A exhibited a much poorer capability to crosslink exportin-t. It is concluded that U47 may be a major contact site between tRNAPheT.th and exportin-t. Secondly, the binding abilities of different tRNA species in calf liver tRNABulk to exportin-t was examined by affinity chromatography on immobilized exportin-t. With a stepwise elution of 250 mM and 500 mM KCl, tRNABulk was fractionated into 2 peaks. Therefore, Different tRNAs bound to exportin-t with different affinity. Among 7 tRNAs tested, the relative affinity to exportin-t ranked as tRNALeuCAG > tRNASerGCU, tRNALeuCAA, tRNASerUGA > tRNASerAGA, tRNALeuAAG > tRNAArgACG. To interpret the different affinity of tRNAs to exportin-t, it is proposed that exportin-t preferentially exports tRNAs that are required the stronger by the protein synthesis machine. The extent of requirement of a specific tRNA by cells is supposed as the ratio between the tRNA concentration in a cell and its codon frequency in the genome, if all tRNAs are supposed to be aminoacylated and transported to ribosome equally. It was found that among 7 tRNAs identified on the 2D urea PAGE, the theoretical estimation of 5 tRNA species upon their requirement by cell ranked the same as their relative affinity to exportin-t. Finally, atomic force microscopy was used to observe exportin-t and its interaction with tRNA in a native and undisturbed state directly. Exportin-t-esterase, immobilized to trifluoromethyl ketone (TFK) modified mica surface, showed a diameter of 15 ± 2 nm. After binding tRNA and Ran•GppNHp, the diameter of the complex somewhat increased to 16 ± 2 nm.

Abstract in weiterer Sprache

In dieser Doktorarbeit wurde die ternäre Komplexbildung von tRNA mit Exportin-t•Ran•GTP durch biochemische und biophysikalische Methoden untersucht. Zunächst wurden die Kontaktstellen zwischen tRNA und Exportin-t durch Licht-induzierte Quervernetzung (Photocrosslinking) bestimmt. Hierzu wurde 4-Thiouridin (s4U) über in vitro Transkription mit T7 RNA Polymerase in tRNAPheT.th eingebaut und mit Licht bei 312 nm bestrahlt. Die Quervernetzung war Ran•GTP abhängig und konnte durch andere tRNA kompetitiv inhibiert werden. Beides unterstreicht die spezifische und produktive Komplexbildung unter den Meßbedingungen. Proteinase K Verdau des (s4U)tRNAPheT.th Komplexes und Reverse Transkriptase-abhängige Primer-Verlängerung erlaubte die Positionen quervernetzter Nukleotide zu ermitten. Der Transkriptionsarrest erfolgte an den Positionen U55, U47, U33 und U20, wobei U47 und U55 die Hauptprodukte darstellten. Mutation von U47 zu A (U47A) sollte die Bedeutung dieser Position klären, wobei das mutierte Transkript von Exportin-t ohne große Affinitätseinbußen gebunden wurde. Die gesamte Quervernetzungsausbeute des U47A-Transkripts verringerte sich aber bei durchgängiger s4U-Modifikation deutlich. Die Position 47 erscheint daher als wichtige Kontaktstelle für die Bindung an Exportin-t. Als Zweites wurden die Bindungsstärken verschiedener tRNA Spezies aus Kalbsleber durch Affinitätschromatographie mittels immobiliserten Exportin-t untersucht. Die stufenweise Elution mit 250 mM und 500 mM KCl erlaubte die Fraktionierung der Total-tRNA in zwei Hauptgruppen. Es scheinen daher deutlich unterschiedliche Bindungsaffinitäten für verschiedene tRNA vorzuliegen. Bei den untersuchten tRNA nimmt die relative Affinität für Exportin-t in der Reihenfolge tRNALeuCAG > tRNASerGCU, tRNALeuCAA, tRNASerUGA > tRNASerAGA, tRNALeuAAG > tRNAArgACG ab. Als mögliche Erklärung der Unterschiede kann darin liegen, daß Exportin-t preferentiell diejenigen tRNA aus dem Kern transportiert die am Notwendigsten für die Aufrechterhaltung der Proteinbiosynthese sind. Als Maß der tRNA-Bedeutung wurde das Verhältnis zwischen der zellulären Konzentration einer bestimmten tRNA und ihrer Codon-Häufigkeit im Genom gewählt. Unter der Vorraussetzung das in erster Näherung alle tRNA gleich aminoacyliert und gleiche Affinität zum Ribosom aufweisen, korrellierten 5 der 7 tRNAs mit der experimentell durch Zweidimensionale-PAGE beobachteten Abstufung. In einem dritten Arbeitsbereich wurde die Rasterkraftmikroskopie verwendet um Exportin-t und seine Wechselwirkung mit tRNA in einem nativen Zustand direkt zu untersuchen. Exportin-t-Esterase wurde auf Trifluoromethylketone(TFK)-modifizierter Silika immobilisiert und zeigte einen Partikeldurchmesser von 15±2 nm in der freien Form und 16±2 nm im Komplex mit tRNA und Ran•GppNHp.