Automated Oxystat Cultivation and Transcriptomic Analysis of Magnetosome Biosynthesis in Magnetospirillum gryphiswaldense

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Riese, Cornelius N.:
Automated Oxystat Cultivation and Transcriptomic Analysis of Magnetosome Biosynthesis in Magnetospirillum gryphiswaldense.
Bayreuth , 2024 . - 103 S.
( Dissertation, 2023 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In order to find their preferred growth conditions, the so called magnetotactic bacteria (MTB) evolved the ability to biomineralize membrane-enveloped magnetic nanoparticles for navigation along the Earth’s magnetic field lines. Because of their unprecedented uniformity in size and shape, chemical purity of the magnetite crystal magnetosomes have become a model for bacterial organelle biosynthesis, biotechnology and synthetic biology. The investigation of the alphaproteobacterium Magnetospirillum gryphiswaldense as a model organism for the complex process of magnetosome biosynthesis led to the identification of >30 genes organized in five putative operons all located in the genomic magnetosome island, which exert tight control of magnetite biomineralization. However, the transcriptional organization and regulation of magnetosome gene clusters during magnetosome biosynthesis is only poorly understood. In addition, the influence of auxiliary metabolic processes and the effect of growth conditions on magnetosome formation and magnetite crystal maturation remains elusive. To address these questions, highly controlled growth conditions are needed to ensure reproducible magnetosome biosynthesis. Hence, during the first part of this thesis, an automatic oxystat cultivation regime in a 3 L bioreactor was developed. The programmed automated cascade regulation enabled highly reproducible growth and analysis of magnetosome biosynthesis over a wide range of precisely controlled oxygen concentrations. The precise oxygen control resulted in improved properties as demonstrated by a combination of complementary analytical techniques including quantitative transmission electron microscopy (TEM) and small-angle X-ray scattering (SAXS). Additionally, based on the precise analysis of substrate consumption, fed-batch fermentation processes will result in higher cell and magnetosome yields. The established oxystat regime was then utilized in the second part of the study for the comparative investigation of the global transcriptome during magnetosome formation. Up-to-date RNA-sequencing techniques including Cappable-sequencing, whole transcriptome shotgun sequencing and 3’ end sequencing revealed (i) a much more complex architecture of the large magnetosome operons (MagOPs) and (ii) internal transcription start sites (TSS) originating from biologically meaningful promoters drive their proper transcription. Although different oxygen concentrations led to differences in TSS detection, most of the magnetosome biosynthesis specific genes were expressed constitutively. Furthermore, transcriptome-wide analysis showed that genes with direct or indirect function in respiratory processes were highly upregulated under magnetosome formation conditions, and a complex interplay between generic metabolic processes such as intracellular redox control and denitrification, and magnetosome biosynthesis was uncovered. The first global and comparative promoter analysis in an MTB during this study revealed that the transcriptional complexity of the magnetosome gene clusters depended on the applied oxygen conditions. Altogether, the results demonstrate that the transcriptional organization of magnetosome gene clusters is more complex than previously assumed. In future, the gathered insights could be used for rational reengineering of synthetic magnetosome gene clusters for enhanced as well as inducible expression for higher magnetosome yields in homologous and potentially in heterologous hosts.

Abstract in weiterer Sprache

Magnetotaktische Bakterien (MTB) haben die Fähigkeit entwickelt, entlang des Erdmagnetfeldes zu navigieren, um Sedimentzonen zu erreichen, die ihnen optimale Wachstumsbedingungen bieten. Dieses magnetotaktische Verhalten ist auf membranumhüllte magnetische Nanopartikel, die Magnetosomen, zurückzuführen. Aufgrund ihrer Uniformität, Monodispersität, chemischen Reinheit des Magnetitkristalls sowie ihres großen Potenzials in der biomedizinischen Anwendung sind Magnetosomen zu einem Modell für die Biosynthese bakterieller Organellen in der Biotechnologie und synthetischen Biologie geworden. Als einer dieser Organismen wurde das Alphaproteobakterium Magnetospirillum gryphiswaldense zum Modellorganismus zur Erforschung des komplexen Prozesses der Magnetosomenbiosynthese. Es wurde ein hohes Maß an Regulation durch mehr als 30 Gene identifiziert, die in fünf mutmaßlichen Operons auf der chromosomalen Magnetosomeninsel organisiert sind. Die transkriptionelle Organisation und Regulation der Magnetosomenbiosynthese ist jedoch nur unzureichend verstanden, wodurch auch der Einfluss von Stoffwechselprozessen und Wachstumsbedingungen auf die Biomineralisation unbekannt bleibt. Um diese offenen Fragen zu beantworten, ist eine reproduzierbare Magnetosomenbiosynthese notwendig, die nur durch hochgradig kontrollierte Wachstumsbedingungen zu gewährleisten ist. Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit zunächst ein automatisches Oxystat-Kultivierungsregime in einem 3 L-Bioreaktor mithilfe einer Sauerstoffkaskade entwickelt. Dies ermöglichte die Kontrolle des Sauerstoffs in einem weiten Sauerstoffbereich und damit ein reproduzierbares Wachstum. Durch Kombination komplementärer Analysetechniken, wie quantitativer Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) wurde gezeigt, dass die präzise Sauerstoffkontrolle zu einem homogenen Magnetitpartikeldurchmesser führte. Weiterhin könnten basierend auf der präzisen Analyse des Substratverbrauchs fed-batch-Fermentationsprozesse entwickelt werden, die in höheren Zell- und Magnetosomenausbeuten resultieren würden. Das etablierte Oxystat-Regime wurde dann im zweiten Teil der Studie zur vergleichenden Untersuchung des globalen Transkriptoms während der Magnetosomenbildung genutzt. Modernsten RNA-Sequenzierungstechniken, einschließlich Cappable-Sequenzierung, Whole transcriptome shotgun sequencing und 3'-Endsequenzierung, zeigten (i) eine komplexere Architektur von Magnetosomen-Operons (MagOPs) sowie (ii) Operon-interne Transcription Start Sites (TSS), die von aktiven Promotoren stammen. Obwohl die betrachteten Sauerstoffkonzentrationen zu Unterschieden im TSS-Nachweis führten, wurden die meisten Magnetosomenbiosynthese-spezifischen Gene konstitutiv exprimiert. Weiterhin zeigte die transkriptomweite Analyse, dass Gene mit direkter oder indirekter Funktion in Atmungsprozessen unter Magnetosomenbildungsbedingungen stark hochreguliert waren. Hier wurde ein komplexes Zusammenspiel zwischen Stoffwechselprozessen wie der intrazellulären Redoxkontrolle sowie der Denitrifikation und Magnetosomenbiosynthese aufgedeckt. Die erste globale und vergleichende Promotoranalyse, die während dieser Studie in einem MTB durchgeführt wurde, zeigte, dass die transkriptionelle Komplexität der Magnetosom-Gen-Cluster von den Sauerstoffbedingungen abhängig sind. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die transkriptionelle Organisation und Regulation komplexer ist als bisher angenommen. In Zukunft könnten aufgrund der gesammelten Daten synthetische Magnetosomenoperons mit verbesserter und induzierbarer Expression entwickelt werden, die zu höheren Magnetosomenausbeuten in homologen und auch heterologen Wirtsorganismen führen könnte.