Thioarsenates in rice plants and grains : implications for food safety

Titelangaben

Colina Blanco, Andrea Ester:
Thioarsenates in rice plants and grains : implications for food safety.
Bayreuth , 2024 . - XX, 157 S.
( Dissertation, 2024 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Rice is typically grown under flooded conditions which mobilizes naturally occurring arsenic (As) from paddy soils. Besides the well-known oxyAs species, inorganic As (iAs: arsenite and arsenate), monomethylarsenate (MMAV), and dimethylarsenate (DMAV), inorganic and methylated thioarsenates have recently been found in paddy soil pore waters. Moreover, the uptake of thioarsenates by rice plants has been confirmed. Amongst methylated thioarsenates, dimethylmonothioarsenate (DMMTA) is particularly relevant because of its high toxicity in mammalian cells. Despite mounting evidence of the ubiquitous presence of thioarsenates in soil pore waters little is known about their interaction with plants and accumulation in grains. This thesis aimed to investigate the relevance of thioarsenates, particularly DMMTA, for food safety and rice plants. The occurrence of thioarsenates in rice grains and products was examined. Additionally, the toxic effects of DMMTA on plants were assessed and the path of DMMTA to the grains, specifically (trans)formation, accumulation, transport, and translocation, was studied in rice plants. The first two studies investigated the occurrence of thioarsenates in rice grains and products. Since routine acid-based extractions co-determined DMMTA as DMAV, a method to detect thioarsenates was developed. The method consists of a two-step enzymatic extraction followed by chromatographic separation with 2.5 100 mmol L-1 NaOH as eluent. The extraction efficiency of the method was confirmed by using a rice-certified reference material. Contents of DMAV, iAs, and sum of As species were all in agreement with the certified values. Formation of DMMTA during the enzymatic extraction was ruled out by the complete recovery of a DMAV spike added before extraction. Analysis of commercial samples showed that thioarsenates, namely DMMTA, dimethyldithioarsenate (DMDTA), and monothioarsenate (MTA) accumulated in the grains. Notably, puffed rice cakes had particularly higher contents of thioarsenates in comparison to the rice samples. Screening of a larger dataset of commercial puffed rice cakes (n = 80) revealed that DMMTA and DMDTA were widely present in the samples, accounting for up to 38 and 46% of total As, respectively. Additionally, MTA, dithioarsenate (DTA), monomethylmonothioarsenate (MMMTA), and monomethyldithioarsenate (MMDTA) were also widely present as minor species. A comparison between the As speciation of rice grains and their respective puffed rice cake revealed that the high content of thioarsenates detected in the puffed rice is a consequence of the high temperatures employed during the puffing treatment. Reduced sulfur originating from the thermal degradation of sulfur-containing compounds in rice was speculated to cause thiolation. The following two studies focused on the behavior of DMMTA in plants. Hydroponic experiments with Arabidopsis thaliana demonstrated DMMTA caused a strong root growth inhibition, more than arsenite and by far more than DMAV. Unlike arsenite, DMMTA exposure did not lead to the accumulation of reactive oxygen species but caused deformation of root epidermal cells revealing different toxicity mechanisms between the As species. Furthermore, like DMAV, the phytochelatin pathway did not contribute to DMMTA detoxification, hence speciation in roots and shoots revealed efficient translocation of DMMTA within plants. Shoot growth and development were also severely affected by the translocated DMMTA. Alterations such as curling of the leaves due to dehydration, decrease in chlorophyll a and b and carotenoids, and accumulation of anthocyanins were observed. Hydroponic experiments with rice plants during grain filling revealed that both DMMTA- and DMAV-exposed plants accumulated similar shares of DMMTA in the leaves, grains, and husks and DMDTA in the leaves and grains, unveiling in planta (de)thiolation processes. Stem-girdling experiments indicated preferential transport of DMMTA in the phloem. Phloem transport was further confirmed by the detection of DMMTA in grains after flag leaf-feeding experiments. For the first time, arsenite and MMAV in planta thiolation was observed in rice seedlings. In planta thiolation of DMAV was also detected in A. thaliana and the kinetics of DMAV thiolation showed this process is not purely abiotic. Significantly lower DMAV thiolation was observed in glutathione (GSH) deficient mutants compared to wild-type A. thaliana plants, thus suggesting GSH concentration as an important parameter influencing in planta thiolation of As species. The fifth study merged our findings and other evidence available on thioarsenates occurrence in rice and thioarsenates detection challenges and put it in context with cytotoxicity data and regulatory limits for As in rice worldwide. The study highlighted that overlooking thioarsenates poses a potential food safety threat, particularly when it comes to the misidentification of highly cytotoxic DMMTA as unregulated DMAV. Overall, our findings revealed the importance of studies on the interaction of thioarsenates, specially DMMTA, with plants with respect to food safety. DMMTA was shown to be highly mobile and toxic for plants. Even in the absence of thioarsenates in soil pore water, in planta thiolation of DMAV can lead to DMMTA and DMDTA accumulation in grains. The occurrence of thioarsenates in commercial rice grains and puffed rice cakes indicates that further monitoring and risk assessment characterization of ingesting thioarsenate-containing rice is urgently needed.

Abstract in weiterer Sprache

Reis wird in der Regel unter gefluteten Bedingungen angebaut, wodurch natürlich vorkommendes Arsen (As) aus den Reisböden mobilisiert wird. Neben den bekannten Oxy-As-Spezies, anorganischem As (iAs: Arsenit und Arsenat), Monomethylarsenat (MMAV) und Dimethylarsenat (DMAV) wurden vor Kurzem auch anorganische und methylierte Thioarsenate im Porenwasser von Reisböden gefunden. Außerdem wurde die Aufnahme von Thioarsenaten durch Reispflanzen bestätigt. Unter methylierten Thioarsenaten ist Dimethylmonothioarsenat (DMMTA) aufgrund von nachweislich hoher Toxizität in Säugetierzellen, besonders relevant. Trotz zunehmender Nachweise von Thioarsenaten im Reisboden Porenwasser ist derzeit nur wenig über die Interaktion mit Pflanzen und deren Akkumulation im Reiskorn bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung von Thioarsenaten, insbesondere von DMMTA, für die Lebensmittelsicherheit und Reispflanzen zu erforschen. Das Vorkommen von Thioarsenaten in Reiskörnern und Reisprodukten wurde untersucht. Darüber hinaus wurden die toxischen Effekte von DMMTA auf Pflanzen beurteilt und der Weg von DMMTA zu den Reiskörnern, mit besonderem Fokus auf Bildung, Umwandlung, Akkumulation, Transport und Translokation, in Reispflanzen untersucht. In den ersten beiden Studien wurde das Vorkommen von Thioarsenaten in Reiskörnern und Reisprodukten untersucht. Da etablierte säurebasierte Extraktionen DMMTA als DMAV erfassen, wurde eine Methode zum Nachweis von Thioarsenaten entwickelt. Diese umfasst eine zweistufige enzymatische Extraktion und eine anschließende chromatografische Trennung mit 2,5 100 mmol L 1 NaOH als Elutionsmittel. Die Extraktionseffizienz der Methode wurde mit zertifizierten Reis Referenzmaterial bestätigt. Gehalte von DMAV, iAs und Summe der As Spezies stimmten mit den zertifizierten Werten überein. Bildung von DMMTA während der Extraktion konnte durch vollständige Wiederfindung, von vor der Extraktion zugesetzten DMAV, ausgeschlossen werden. Die Analyse von handelsüblichen Waren zeigte, dass sich Thioarsenate, besonders DMMTA, Dimethyldithioarsenat (DMDTA) und Monothioarsenat (MTA), in den Reiskörnern anreichern. Reiswaffeln wiesen im Vergleich zu Reisproben einen besonders hohen Gehalt an Thioarsenaten auf. Screening eines umfangreichen Datensatzes kommerziell erwerblicher Reiswaffeln (n = 80) zeigte eine weite Verbreitung von DMMTA und DMDTA, die jeweils bis zu 38 und 46 % des gesamt-As Gehaltes ausmachten. Darüber hinaus waren MTA, Dithioarsenat (DTA), Monomethylmonothioarsenat (MMMTA) und Monomethyldithioarsenat (MMDTA) in geringeren Konzentrationen ebenfalls weit verbreitet. Ein Vergleich der As-Speziierung von Reiskörnern und jeweils zugehöriger Reiswaffeln zeigte, dass der hohe Gehalt an Thioarsenaten in Reiswaffeln eine Folge der hohen Temperaturen ist, die bei dem Reispuffen angewendet werden. Es wurde vermutet, dass reduzierter Schwefel, der durch die thermische Zersetzung schwefelhaltiger Verbindungen im Reis entsteht, die Thiolierung verursacht. Die beiden folgenden Studien befassten sich mit dem Verhalten von DMMTA in Pflanzen. Hydroponische Experimente mit Arabidopsis thaliana zeigten eine starke Hemmung des Wurzelwachstums durch DMMTA, stärker als durch Arsenit und bei weitem stärker als durch DMAV. Im Gegensatz zu Arsenit führte die Exposition mit DMMTA nicht zur Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies, sondern verursachte eine Deformation der epidermalen Wurzelzellen, was auf unterschiedliche Toxizitätsmechanismen der beiden As-Spezies hinweist. Außerdem, ähnlich wie bei DMAV, trugen Phytochelatine nicht zur Entgiftung von DMMTA bei, da die As-Speziierung in den Wurzeln und Sprossen eine effiziente Verlagerung von DMMTA innerhalb der Pflanzen ergab. Auch das Wachstum und die Entwicklung der Sprossen wurden durch das Verlagern von DMMTA stark beeinträchtigt. Veränderungen, wie das Kräuseln der Blätter aufgrund von Austrocknung, eine Abnahme von Chlorophyll a und b und Carotinoiden sowie eine Anhäufung von Anthocyanen wurde beobachtet. Hydroponische Experimente mit Reispflanzen während der Reiskornfüllungsphase zeigten, dass sowohl DMMTA- als auch DMAV-exponierte Pflanzen ähnliche Anteile an DMMTA in den Blättern, Körnern und Schalen, und DMDTA in den Blättern und Körnern akkumulierten, was in planta Dethio- bzw. Thiolierungsprozesse zeigt. Stamm-girdling Experimente zeigten, dass DMMTA bevorzugt über das Phloem transportiert wird. Zusätzlich konnte der Transport im Phloem durch den Nachweis von DMMTA in den Reiskörnern über das Fahnenblatt exponierter Pflanzen bestätigt werden. Darüber hinaus wurde in planta Thiolierung von Arsenit und MMAV zum ersten Mal in Reissetzlingen beobachtet. In planta Thiolierung von DMAV konnte auch in A. thaliana nachgewiesen werden und die Kinetik der DMAV-Thiolierung zeigte, dass die Thiolierung kein rein abiotischer Prozess ist. Eine deutlich geringere DMAV-Thiolierung wurde in Mutanten mit Glutathion (GSH)-Mangel im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen von A. thaliana beobachtet, was darauf hindeutet, dass die GSH-Konzentration ein wichtiger Parameter ist, der die Thiolierung von As-Spezies in planta beeinflusst. In der fünften Studie wurden unsere Ergebnisse mit anderen verfügbaren Ergebnissen zum Vorkommen von Thioarsenaten in Reis und Problemen beim Nachweis von Thioarsenaten zusammengeführt und in Zusammenhang mit den Zytotoxizitätsdaten und den weltweit geltenden Grenzwerten für As in Reis gebracht. Diese Studie verdeutlichte, dass das Übersehen von Thioarsenaten eine potenzielle Gefahr für die Lebensmittelsicherheit darstellt, insbesondere wenn es um die falsche Identifizierung von hoch zytotoxisches DMMTA als unreguliertem DMAV geht. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, wie wichtig Studien über die Wechselwirkung von Thioarsenaten, insbesondere von DMMTA, mit Pflanzen im Hinblick auf die Lebensmittelsicherheit sind. DMMTA erwies sich als sehr mobil und toxisch für Pflanzen. Selbst bei Abwesenheit von Thioarsenaten im Porenwasser des Bodens kann die Thiolierung von DMAV in Pflanzen zu einer Anreicherung von DMMTA und DMDTA in den Reiskörnern führen. Das Vorkommen von Thioarsenaten in handelsüblichen Reiskörnern und Reiswaffeln unterstreicht, dass ein weiteres Monitoring und eine Risikobewertung zum Verzehr von thioarsenathaltigem Reis dringend erforderlich sind.