Funktionelle Charakterisierung und Positionierung von Drosophila Cenp-C im Zentromer/Kinetochor-Komplex

Titelangaben

Heeger, Sebastian:
Funktionelle Charakterisierung und Positionierung von Drosophila Cenp-C im Zentromer/Kinetochor-Komplex.
Bayreuth , 2006
( Dissertation, 2007 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die korrekte Verteilung der genetischen Information während der Mitose ist wesentlich für den Erhalt der genetischen Stabilität. Die Chromatiden der linearen Chromosomen der Eukaryoten werden in der Anaphase durch die mitotische Spindel zu gegenüberliegenden Polen transportiert. Die Spindel greift hierbei an spezialisierten Strukturen der Schwesterchromatiden an. Diese Strukturen, bestehend aus der zentromeren DNS und angelagerten Zentromer- und Kinetochorproteinen, werden im Folgenden Zentromer/Kinetochor-Komplex (kurz CKC für "centromere kinetochore complex") genannt. Die Basis des CKC bilden die konstitutiven Komponenten, welche während des gesamten Zellzyklus am CKC lokalisieren. Cenp-A, eine für das Zentromer spezifische Variante des Histon H3, war bis vor Kurzem die einzige bekannte ubiquitäre konstitutive Komponente des CKC. Mit der Identifizierung des stark abgeleiteten Cenp-C von Drosophila wurde eine weitere konstitutive Komponente enthüllt. Das Cenp-C-Motiv, das einzige kurze Stück mit konservierter Aminosäuresequenz unter den bekannten Cenp-C-Homologen, konnte als notwendig für die CKC-Lokalisierung bestätigt werden. Untersuchungen des Cenp-C-mutanten Phänotyps belegten die essentielle Rolle von Cenp-C beim Aufbau eines funktionellen CKC. Während der Mitose dienen die konstitutiven CKC-Komponenten als Plattform für die Anlagerung transienter CKC-Komponenten, welche die Interaktion mit der Spindel vermitteln. Zu den transienten CKC-Komponenten gehören der Ndc80- und der MIND-Komplex. Die Identifizierung der Drosophila Ndc80- und MIND-Komplex-Untereinheiten (Ndc80, Nuf2, Spc25, Mis12, Nsl1, Nnf1a, Nnf1b) in dieser Arbeit bekräftigt die Existenz einer konservierten CKC-Struktur. Überdies wurden verschiedene fluoreszierende Fusionsproteine von CKC-Komponenten verwendet, um, nach mikroskopischer Untersuchung neuartig präparierter nativer mitotischer Chromosomen, eine Karte des CKC mit bisher ungekannter Auflösung zu erstellen. Die Interaktion der CKC mit der Spindel wird von einem komplizierten Mechanismus überwacht, der Spindelkontrollpunkt genannt wird. Die Proteine des Spindelkontrollpunktes reichern sich an den CKC an, welche noch nicht korrekt in die Spindel integriert wurden. In vivo Mikroskopie wurde benutzt, um die CKC-Lokalisierung des Spindelkontrollpunktproteins Mps1 zu charakterisieren. Zudem wurde das Verhalten von Cenp-C, der Ndc80-Komplex-Komponente Nuf2 und Mps1 als Antwort auf eine beschädigte Spindel nach Sauerstoffentzug untersucht.

Abstract in weiterer Sprache

Faithful distribution of genetic information during mitosis is essential for the maintenance of genetic stability. In eukaryotes, sister chromatids of linear chromosomes are distributed to opposite poles by the mitotic spindle during anaphase. For this purpose, the spindle has to attach to specialized structures within the sister chromatids. In the following, these structures which are formed by centromeric DNA sequences and associated centromere/kinetochore proteins will be designated as the centromere kinetochore complex (CKC). The basis of the CKC is formed by constitutive centromere proteins, which localize to the CKC throughout the cell cycle. A centromere-specific histone H3 variant, Cenp-A, has been the only known ubiquitous constitutive component until recently. With the identification of the strongly diverged Drosophila Cenp-C, an additional constitutive component was revealed here. The Cenp-C motif, the only brief stretch of amino acids present in all known Cenp-C homologs, was shown to be required for CKC localization. Analysis of the Cenp-C mutant phenotype demonstrated its essential role for the formation of a functional CKC. During mitosis, the constitutive CKC components serve as a platform for the recruitment of the transient CKC components, which mediate the attachment to the spindle. Transient CKC components include the Ndc80 and MIND complexes. With the identification of Drosophila Ndc80 and MIND complex subunits (Ndc80, Nuf2, Spc25, Mis12, Nsl1, Nnf1a, Nnf1b) the notion of a conserved CKC design principle was further enforced here. Moreover, fluorescent fusion proteins of various CKC components were used to generate a CKC map at unprecedented resolution by microscopic analyses of novel preparations of native mitotic chromosomes. The interaction between CKCs and the spindle is monitored by a surveillance mechanism called mitotic spindle checkpoint. Mitotic spindle checkpoint proteins concentrate on CKCs which have not yet been integrated properly into the mitotic spindle. Here, in vivo imaging was used to characterize the localization of the mitotic spindle checkpoint component Mps1 on the CKC. Moreover, the behavior of Cenp-C, the Ndc80 component Nuf2 and Mps1 was analyzed in response to spindle damage resulting from oxygen deprivation.