Partikel und Kapseln auf Basis des rekombinanten Spinnenseidenproteins eADF4(C16)

Titelangaben

Blüm, Claudia:
Partikel und Kapseln auf Basis des rekombinanten Spinnenseidenproteins eADF4(C16).
Bayreuth , 2014
( Dissertation, 2013 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Natürliche Spinnenseide als Biomaterial wird aufgrund seiner einzigartigen mechanischen Eigenschaften und seiner guten Biokompatibilität schon seit Jahrhunderten vom Menschen genutzt. Hierbei sind insbesondere die Proteine des Abseilfadens der Gartenkreuzspinne A. diadematus von Interesse. Der Abseilfaden setzt sich aus mehreren Proteinkomponenten zusammen, eine dieser Komponenten ist das Protein ADF4, diesem nachempfunden ist das rekombinant hergestellte Protein eADF4. ADF4 besteht aus bis zu 100 Wiederholungen einer repetitiven Kernsequenz, welche von nicht-repetitiven terminalen Regionen flankiert wird. eADF4 besteht aus dieser, jedoch für E. coli optimierten, Kernsequenz (C-Modul). In dieser Arbeit lag das Hauptaugenmerk auf eADF4(C16). Dieses besteht aus 16 Wiederholungen des C-Moduls, das daraus resultierende Protein hat ein Molekulargewicht von ca. 47 kDa. Die kontrollierte und gezielte Freisetzung von Wirkstoffen oder Enzymen (controlled drug delivery) ist ein wichtiges Forschungsgebiet sowohl in der Pharmazie als auch in der Medizin. Mittels controlled drug delivery sollen Probleme der herkömmlichen Medikamentation behoben werden. Hierzu zählen beispielsweise Nebenwirkungen die aufgrund einer sehr hohen lokalen Wirkstoffkonzentration nach Injektion des Wirkstoffs oder nach Auflösen einer Tablette am Wirkort auftreten können. Um dies zu minimieren, sollen Depotsysteme Medikamente kontrolliert über einen längeren Zeitraum am gewünschten Wirkort abgeben. Hierfür eignen sich insbesondere mobile Systeme, wie Partikel und Kapseln. Bei Partikeln aus eADF4(C16) handelt es sich um Vollkugeln, welche durch Aussalzprozesse aus wässriger Lösung hergestellt werden. Sie eignen sich insbesondere für den Transport von wasserlöslichen Stoffen, was am Beispiel Rhodamin B gezeigt wurde. Die Beladung der Partikel erfolgt hierbei auf zwei verschiedene Arten. Zum einen durch Eindiffundieren der Wirkstoffe in die fertig ausgebildeten Partikel, zum anderen durch co-Präzipitation des Wirkstoffs zusammen mit dem Protein. Es konnte gezeigt werden, dass die Beladung der Partikel mit Wirkstoffen durch co-Präzipitation im Vergleich zu Diffusionsprozessen deutlich erhöht werden konnte. Zusätzlich sollte durch Vernetzungsprozesse (crosslinking) Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung genommen werden. Dies konnte jedoch nicht in vollem Umfang erzielt werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass chemisches Vernetzen einen deutlichen Einfluss auf die chemische Stabilität der Partikel hat und dass sowohl chemisches als auch physikalisches Vernetzen die Mechanik der Partikel stark beeinflusst. Zusätzlich konnte das Quellverhalten der Partikel analysiert werden, was einen entscheidenden Einfluss auf ihre Lagerstabilität aufweist. Sowohl die Mechanik als auch die Oberflächeneigenschaften der Partikel sind wichtige Parameter in Bezug auf weitere Anwendungsmöglichkeiten. Insbesondere im Bereich der Kompositmaterialien sind die Partikel vielseitig einsetzbar. Durch Inkorporation von eADF4 Partikeln in eine Matrix können die mechanischen Eigenschaften des Matrixmaterials möglicherweise stark verbessert werden und durch die Bioabbaubarkeit der Partikel ergeben sich weitere Möglichkeiten im Bereich von Knochenersatzmaterialien. Bei Kapseln handelt es sich um flüssigkeitsgefüllte Systeme, die von einem dünnen, aber stabilen Seidenfilm umhüllt sind. Die Kapselherstellung erfolgt mittels Grenzflächenpolymerisation an der Grenzfläche zwischen Öl und Wasser. Das bisher etablierte System basiert auf der Verwendung von Toluol, welches in Hinblick auf eine medizintechnische Anwendung bedenklich ist. Kapseln als Transportsystem eignen sich sowohl für schlechtlösliche als auch für gut-wasserlösliche Wirkstoffe mit einem Molekulargewicht größer als 30 kDa. Durch die Herstellung von Kapseln mittels Silikonöl anstatt Toluol, konnte ihre Verwendung als Transportsystem für Enzyme erfolgreich gezeigt werden. Dies erfolgte mittels -Galaktosidase als Modellenzym. Die Substrate können, aufgrund der semi-permeablen Kapselhülle, in die Kapseln eindiffundieren, bestimmte Proteasen mit entsprechend großem Molekulargewicht werden jedoch abgehalten. Ein Vorteil der Spinnenseidenkapseln gegenüber anderen Systemen ist, dass auch inaktive Enzyme verkapselt und am Wirkort durch Zugabe des Aktivators gezielt aktiviert werden können. Um eine möglichst homogene Größenverteilung der Kapseln zu erzielen, wurde eine Herstellung mittels Mikrofluidik erprobt. Um die Anwendbarkeit von eADF4 Proteinen im medizinischen oder pharmazeutischen Bereich sicherstellen zu können ist die Sterilität der Proteine ein entscheidendes Kriterium. Rekombinante Proteine, speziell solche, die in Bakterien produziert wurden, sind in der Regel auch nach Aufreinigung unsteril. Aus diesem Grund wurden in meiner Arbeit verschiedene Sterilisationsmethoden getestet und ihre Auswirkungen auf die rekombinanten Spinnenseidenproteine analysiert.

Abstract in weiterer Sprache

Natural spider silk has been used as a biomaterial for centuries due to its unique mechanical properties and its biocompatibility. The dragline silk proteins of the European garden cross spider A. diadematus are of special interest. Araneus diadematus fibroin 4 (ADF4) is one of this dragline silk´s protein components and it has been used as a template for the engineered Araneus diadematus fibroin 4 (eADF4). ADF4 is composed of up to 100 repetitions of the repetitive core sequence which is flanked by non-repetitive terminal regions. eADF4 consists of several repetitions of a mimic of the core sequence (known as the C-module), which has been optimized for production in E coli. Theoretically the C-module can be repeated many times, the number of repetitions defining the size of the resulting protein, however E. coli can not translate large proteins faultlessly, which limits the size of the proteins that can be produced. In this work, the main focus was eADF4(C16) which consists of 16 repetitions of the C-module resulting in a molecular weight of around 47 kDa. Controlled drug delivery as well as controlled enzyme transport is one focus of medical and pharmaceutical research. By using controlled drug delivery, many problems of traditionally drug delivery can be overcome. Side effects due to local drug concentrations being toxic after injections or dissolution of tablets are problems which have to be solved. Therefore, depot systems with a controlled release of drugs over a longer period of time are of interest. Mobile systems like particles or capsule are also suitable. eADF4(C16) particles are produced by a precipitation step and they are suitable for the transport of water-insoluble drugs, which has been shown for rhodamine B, a model drug. Drug loading of particles can be performed either by co-precipitation of the drug molecules together with the protein or by diffusion, with the co-precipitation step resulting in the highest loading. The influence of crosslinking on drug release was investigated; however, we observed no significant increase in the duration of release. Nevertheless, an increase in chemical stability due to the chemical crosslinking was achieved. Chemical as well as physical crosslinking influenced the mechanical behavior and the swelling ratio of the particles which also influences the storage stability. The mechanical as well as the surface properties of eADF4(C16) particles are important parameters in regard to their possible applications. Composites are an interesting application field for the particles. By incorporating the particles into a matrix, the mechanical behavior of the matrix material can be enhanced, and the biodegradability of the recombinant spider silk particles render them attractive for incorporation in bone tissue scaffolds. Capsules are in contrast to particles, liquid filled systems which are enclosed by a thin but stable silk film. They are produced by self-assembly of the protein at the oil-water interface. Until now, the established system was based on the use of toluene as the oil phase, which is a problem for medical applications. Capsule-based transport systems can be used for both water soluble and water insoluble drugs with a molecular weight larger than 30 kDa. The substitution of toluene by silicon oil enabled the successful encapsulation of enzymes with -galactosidase being used as a model enzyme. Due to the semi-permeable capsule membrane, the substrates for -galactosidase can diffuse freely through the membrane while proteases with a molecular weight larger than the pore size are excluded. Because of these properties, the capsules can be used as reaction containers, their contents shielded from proteases. One benefit of spider silk capsules in contrast to other systems is that even inactive enzymes can be encapsulated and by adding the activator, the capsules can be activated at the desired location. By this method, unwanted side reactions within the body can be avoided. To achieve an optimal uniform size distribution, a microfluidic-based system was tested as a potential production method. To be able to use the eADF4 proteins in the medical and pharmaceutical field, sterile protein is a crucial criterion. Recombinant proteins, especially if they are produced in bacteria, are non-sterile even after purification. Therefore different sterilization techniques were tested and their influence on the recombinant spider silk protein analyzed.