Studien zur Biosynthese des Ambruticin-Mittelfragments

Titelangaben

Wunderlich, Johannes:
Studien zur Biosynthese des Ambruticin-Mittelfragments.
Bayreuth , 2023 . - 287 S.
( Dissertation, 2023 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Aufklärung der Ambruticin-Biosynthese. Die Ambruticine sind Polyketidnaturstoffe aus dem Myxobakterium Sorangium cellulosum So ce10, welche über einen sehr selektiven Mechanismus fungizid wirken. Dies macht sie als neuartige Antimykotika interessant. Ein Umstand, der dem kommerziellen Nutzen aber im Wege steht, ist die hohe strukturelle Komplexität. Diese Komplexität wird durch eine außerge-wöhnliche Biosynthese erreicht. Aktuell stützen sich die Annahmen zu deren Ablauf v.a. auf die Genclusteranalyse und die Isolierung von Intermediaten aus knockout-Experimenten durch Reeves et al. und die Studien von Hahn et al. Der Ablauf der Biosynthese des mittleren Divinylcyclopropyl-Fragments ist allerdings noch unklar. Nur die Eckpunkte davon, ein ACP-gebundenes Intermediat aus Modul 5 (AmbD) und das bereits abgespaltene Ambruticin J, sind bisher bekannt. Die Hypothese von Hahn et al. ist, dass AmbF die Bildung des Cyclopropans katalysiert, gefolgt von AmbG welches die Entfernung einer Kohlenstoffeinheit durch AmbI ermöglicht. Die vorliegende Arbeit ist der Versuch Licht in das Dunkel der Bildung des Divinylcyclopropyl-Mittelfragments durch AmbF zu bringen. Dieses Ziel sollte durch einen interdisziplinären Ansatz aus Strukturbiologie, Molekularbiologie und Enzymologie mit hochrealistischen Substraten erreicht werden. Es wurde eine neue Hypothese zu den AmbF-katalysierten Reaktionen aufgestellt, welche auf den chemischen Eigenschaften der Substrate, dem Vergleich mit anderen Biosynthesen und den strukturellen Besonderheiten von AmbF beruht. Nach der Bildung eines mehrfach ungesättigten β-Ketopolyens in einer Verlängerungsreaktion mit einer noch unbekannten trans-AT erfolgt die Bildung eines Imins mit dem Cofaktor Pyridoxaminphosphat. Dieser erleichtert als electron sink factor die nachfolgenden Reaktionen. In einem Additions-Eliminierungs-Mechanismus findet dann der Ringschluss zum Cyclopropan durch einen Elektronenshift entlang des konjugierten π-Systems statt. Das dabei simultan gebildete Cyclopropanon wird dann durch die Hydrolase-Domäne in einer Favorskii-artigen Umlagerung zur verzweigten Carbonsäure geöffnet. Zur Überprüfung der postulierten Biosynthese wurden möglichst realistische Surrogate vom postuliertem ACP-gebundenen Substrat synthetisiert. Dafür wurde nach ausgiebigen Optimierungsarbeiten ein Protokoll für die Synthese von mehrfach ungesättigten β-Ketothioaten entwickelt. Mit diesem können diese schnell, flexibel und mit guten Ausbeuten sowie hervorragenden Selektivitäten dargestellt werden. In einer ausgegliederten Untersuchung zur Stereoselektivität der Ketoreduktasedomäne MycKRB aus der Mycotoxin-Biosynthese wurde der große Praxisnutzen der Synthese und der damit hergestellten Substrate unter Beweis gestellt. Hier wurde gezeigt, dass in vitro-Experimente präziser die natürliche Selektivität abbilden, wenn charakteristische Strukturelemente in den Surrogaten vorhanden sind. Das bekräftigt wiederum den Ansatz dieses Projekts in den in vitro-Versuchen zu den AmbF-Domänen möglichst realistische Substrate einzusetzen. Durch bioinformatische Untersuchungen, insbesondere durch Strukturhomologiemodelle, wurden die Domänengrenzen der an der Zyklisierung beteiligten Domänen aus AmbF neu bestimmt. Auch wurde gezeigt, dass die Px-Domäne aus einer kleinen (PxN) und einer großen Subdomäne (PxC) besteht, während in der Literatur nur ein C-terminaler Teil der großen Subdomäne angegeben wird. Diese neuen Sequenzen wurden erfolgreich in pET28a(+)-Expressionvektoren kloniert. Während die heterologe Proteinproduktion der Px-Domäne in den von Reeves et al. gesetzten Grenzen scheiterte, konnte sowohl die HPx-Didomäne, als auch die neu eingegrenzte PxNC-Domäne in E. coli löslich hergestellt werden. In den Aktivitätstests zu den AmbF-Domänen H und Px konnte keine enzymatische Aktivität mit dem Substratsurrogat nachgewiesen werden. In künftigen Experimenten sollten allerdings beispielsweise noch weitere Reaktionsbedingungen oder ein erweitertes Substratsspektrum getestet werden. Mit dieser Arbeit wurde das Fundament gelegt, auf dem weitere Versuche zur Aufklärung der Biosynthese des Ambruticin-Mittelfragments aufgebaut werden können. Für die Charakterisierung von AmbG wurden verschiedene Carbonsäuren synthetisiert. Aus der Substratselektivität und bioinformatischen Analyse lässt sich schließen, dass AmbG eine FAAL-ACP-Didomäne mit einer außergewöhnlich breiten Substrattoleranz ist. Damit konnte die Hypothese, dass die Ambruticin-Biosynthese über die Aktivierung der verzweigten Thioestercarbonsäure abläuft, gestützt werden.

Abstract in weiterer Sprache

The present thesis deals with the elucidation of the ambruticin biosynthesis. Ambruticins are polyketide natural products from the myxobacterium Sorangium cellulosum So ce10, which is fungicidal by a unique mechanism. This arouses interest as novel antimycotic. However, the structural complexity makes industrial synthesis difficult. This complexity is based on an extraordinary biosynthesis. The proposed biosynthetic mechanism is evolved from gene cluster analysis, the isolation of intermediates from knockout strains by Reeves et al. and enzymological studies by Hahn et al. However the biosynthesis of the middle divinylcyclopropyl fragment is currently completely unknown. Only the surrounding cornerstones, the ACP-bound intermediate from module 5 (AmbD) and ambruticin J, are known so far. The current hypothesis by Hahn et al. is that AmbF catalyzes the formation of a cyclopropane, subsequently AmbG enables the removal of a carbon moiety by AmbI. The present work was an attempt to enlight the formation of the divinylcyclopropyl middle fragment by AmbF. This should be achieved by an interdisciplinary approach from structural biology, molecular biology, and enzymology with highly realistic substrate surrogates. A new hypothesis on the AmbF-catalyzed reactions was put forward, based on the chemical properties of the substrates, the comparison with recently reported biosyntheses and structural peculiarities of AmbF. After an elongation to a β-ketopolyene via a trans-AT the formation of an imine with the cofactor PMP takes place, facilitating the subsequent reactions as an electron sink factor. The cyclopropane is built via an addition-elimination mechanism by an electron shift along the conjugated π-system. The simultaneously formed cyclopropanone is then opened to a branched carboxylic acid in a Favorskii-kind rearrangement by the hydrolase domain. To examine the postulated biosynthesis highly realistic surrogates of the proposed ACP-bound substrate were synthesized. Through extensive optimization work, a protocol for the synthesis of polyunsaturated β-ketothioesters could be developed. It provides access to these compounds in a facile, versatile and step-economic manner with good overall yields and excellent stereoselectivities. In an outsourced study on the stereoselectivity of ketoreductase domain MycKRB from mycotoxin biosynthesis, the great benefit of the synthesis was demonstrated. Here it was shown that in vitro experiments more precisely reflect the natural selectivity when characteristic structural elements are present in the surrogates. This strengthens the approach of this project using best adapted substrate surrogates for the in vitro assays of the AmbF domains. The boundaries of the AmbF domains were redetermined by bioinformatic analysis. It was shown that the Px domain consists of a small (PxN) and a large (PxC) subdomain, while only a C-terminal part of the large subdomain is reported in literature. These new sequences were successfully cloned into expression vectors. While the heterologous protein production of the Px domain according to domain boundaries defined by Reeves et al. failed, both the HPx and the newly assigned PxNC domain were obtained soluble from E. coli. In the activity tests no significant enzymatic effect of the AmbF domains H and Px on a substrate surrogate was observed. In future experiments, for example, other reaction conditions or an extended range of substrates can be tested as well as using the entire AmbF module. However, this work laid the foundation for further experiments to elucidate the biosynthesis of the ambruticin middle fragment. Various carboxylic acids were synthesized for the characterization of AmbG. From substrate selectivity and bioinformatic analysis, it was concluded that AmbG is a FAAL-ACP didomain with exceptionally broad substrate tolerance. This supported the hypothesis that ambruticin biosynthesis proceeds via activation of the branched thioester carboxylic acid.