Entwicklung von Biomaterial- und Biotinten basierend auf rekombinanten Spinnenseidenproteinen

Titelangaben

Lechner, Annika:
Entwicklung von Biomaterial- und Biotinten basierend auf rekombinanten Spinnenseidenproteinen.
Bayreuth , 2023 . - 132 S.
( Dissertation, 2022 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Für die Gewebezüchtung sind multidisziplinäre Ansätze zur Erzeugung artifizieller Organe nötig, um zukünftig auf den Einsatz von Spenderorganen und tierischen Materials verzichten zu können. Neben der Forschung an Zellen und Stammzellen, müssen kompatible Materialien entwickelt werden. Ein funktionales Gewebe kann durch Kombination der entsprechend lebenden Komponente mit einem passenden formgebenden Material entstehen. Dieses sollte im besten Fall mit der Zeit vollständig von den Zellen besiedelt und ab-, beziehungsweise zu zelleigenem Material umgebaut werden. Mit dem Begriff Biofabrikation wird eine Vielzahl an Technologien beschrieben, welche es ermöglichen, Material und Zellen gemeinsam und gleichzeitig zu verarbeiten. Meist werden dafür additive Fertigungstechniken verwendet, die einen heterogenen und hierarchischen Aufbau der Strukturen, wie im natürlichen Vorbild, ermöglichen. Eine Methode der Biofabrikation ist der Biodruck, bei dem aus Zellen und Material bestehende Biotinten in genau definierte dreidimensionale Strukturen extrudiert werden. Neben der technischen Herausforderung ist die Biomaterialkomponente entscheidend für den Erfolg dieser Methoden. Das Material, meist ein Hydrogel, bestimmt die generelle Druckbarkeit der Biotinte und die Viabilität der Zellen. Die im darauffolgenden stattfindende zelluläre Entwicklung und Reifung des Konstruktes muss in vielen Fällen zusätzlich gesteuert werden. Hierfür bietet sich die Stimulation bestimmter zellulärer Prozesse durch die Gabe von Hormonen, Wachstumsfaktoren und anderer Signalmoleküle an. Besonders die Kontrolle über Zeitpunkt und Dauer ist für deren exakte Wirkung wichtig. Um dem Ziel der Biofabrikation näher zu kommen, wurden in der vorliegenden Dissertation verschiedene Ansätze verfolgt. Grundlage hierfür war der 3D-Biodruck von Hydrogelen und Biotinten aus dem rekombinanten Spinnenseidenprotein eADF4(C16) und weiteren davon abgeleiteten Proteinvarianten mit speziellen Funktionen. Der erste Fokus der Arbeit lag auf der Optimierung deren Druckbarkeit, der Entwicklung und Charakterisierung neuer Biotinten mit erhöhter Zelldichte für zukünftige funktionale Konstrukte und der Etablierung von Wirkstoffsystemen zur Erweiterung der Biofabrikationsmöglichkeiten. Dazu wurde der Extrusionsdruck von azellulären Hydrogelen, sogenannten Biomaterialtinten, aus eADF4(C16) betrachtet. Neue Erkenntnisse zur temperaturabhängigen Rheologie sowie dem Einfluss verschiedener Spitzen am Druckkopf führten zur Verbesserung der Druckbarkeit. Es konnte gezeigt werden, dass das rein physikalisch quervernetzte Hydrogel in komplexe Strukturen gedruckt werden kann. Es wurde demonstriert, dass Abstände von mehreren Millimetern verlässlich von einem Filamentstrang in der Luft überbrückt werden können. Dieser Erfolg wurde zusätzlich durch den Druck des Hydrogels in die Form und Größe einer humanen Aortenklappe, reproduzierbar mit zwei verschiedenen Extrusions-druckern, gezeigt. Die gewonnenen Erkenntnisse konnten ebenfalls auf ein neu entwickeltes eADF4(C16)-Gel aus wässrig organischer Mischphase übertragen werden. Zunächst konnte die generelle Druckbarkeit dieser Gele in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden. Außerdem wurde das azelluläre Material ebenfalls zuverlässig durch Extrusion in eine Struktur im Zentimeterbereich und mit überhängenden Abschnitten gebracht. Ein zweiter Fokus der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung neu entwickelter Biotinten. Basierend auf verschiedenen eADF4(C16) Varianten mit einer Zelldichte von bis zu zehn Millionen Zellen pro Milliliter wurden deren Rheologie, Druckbarkeit und Viabilität untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich sowohl das rekombinante Spinnenseidenprotein eADF4(C16) als auch dessen Variante eADF4(C16)-RGD dazu eignen, mit hohen Zelldichten verdruckt zu werden. Auch mit diesen Biotinten konnten Abstände bis zu 16 mm in der Luft überbrückt werden. Die mit dem Integrin-Bindepeptid RGD ausgestattete Variante zeigte zusätzlich einen Vorteil während der darauffolgenden Reifung der Konstrukte. Der dritte Fokus der vorliegenden Arbeit lag in der Entwicklung neuer Wirkstofffreisetzungssysteme. Zunächst konnten die aus wässrig-organischer Phase gebildeten eADF4(C16)-Gele erfolgreich mit dem wasserunlöslichen Wirkstoff 6-Mercaptoruin nicht-kovalent beladen und dessen anschließende Freisetzung gezeigt werden. In Kombination mit der ebenfalls in dieser Arbeit demonstrierten Druckbarkeit der Biomaterialtinte ergeben sich für diese neuartigen Gele beispielsweise Anwendungen als injizierbare Wirkstoffdepots. Der vierte Fokus lag in der Kontrolle der Freisetzung von Substanzen. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit wurden Wirkstoffsysteme durch kovalente Bindung an rekombinante Spinnenseidenproteine etabliert. Dafür wurde sowohl ein redox- als auch ein pH-sensitives System durch genetische und chemische Modifikation auf verschiedene eADF4(C16)-Varianten übertragen. Es konnten Modellwirkstoffe und die in der Chemotherapie relevanten Zytostatika 6 Mercaptopurin und Doxorubicin reversibel an Partikel und Filme aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen gekoppelt werden. Beide Systeme zeigten Stabilität unter physiologischen Bedingungen mit der Möglichkeit zur kontrolliert auslösbaren Freisetzung der Substanzen. Diese Modifikationen erlauben es in Zukunft, Biomaterial- oder Biotinten aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen entweder direkt oder durch zusätzliches Einkapseln beladener Partikel zu funktionalisieren. Dadurch können zelluläre Prozesse während der Reifung der gedruckten Konstrukte gezielt gesteuert werden.

Abstract in weiterer Sprache

Tissue engineering relies on multidisciplinary approaches to generate artificial organs. The goal is to reduce the usage of donor tissue and animal-sourced material. The research requires knowledge about cells and stem cells and biocompatible materials have to be developed. Functional tissues can be generated by combining the appropriate living component and suitable structural parts. In the optimal case, the scaffold is degraded and reorganized by the cells. During this maturation, the cells build up their own extracellular matrix. Biofabrication describes various technologies that enable the simultaneous processing of cells and materials. With the aim to simulate the hierarchical and heterogeneous nature of tissues and organs, mostly additive manufacturing techniques are employed. Bioprinting, for example, is used to deposit so-called bioinks, containing cells and material, in defined three-dimensional structures. In addition to the technical challenges, the success of these methods relies on the material components, which are mostly hydrogels. Their properties decide the printability of the bioinks and the viability of the encapsulated cells. After printing, the constructs have to undergo maturation. This process can and needs to be guided additionally. Cellular development can be stimulation with specific hormones, growth factors, and other signaling molecules. For the desired effect, the exact time and duration of their action have to be controlled. To work towards the goal of biofabrication, different strategies were employed within this dissertation. The bioprinting of hydrogels and bioinks made of the recombinant spider silk protein eADF4(C16) and variants derived thereof were the foundation this thesis was built on. The first focus lay on optimizing their printability, characterizing new bioinks with increased cell densities, and establishing new drug delivery systems on recombinant spider silk proteins to create additional possibilities for biofabrication applications. Therefore, the extrusion printing of acellular eADF4(C16) hydrogels, so called biomaterial inks, was investigated. New insights into temperature-dependent rheological behavior and the effect of different printing nozzles enabled the optimization of the printing outcome. Within this work, printing the physically cross-linked hydrogel into complex structures was demonstrated. Distances of multiple millimeters could be bridged without additional support. This success was verified by creating the shape and size of a human aortic heart valve, reproducible on two different extrusion based bioprinters. The knowledge gained during this part was applied to print a newly developed eADF4(C16)-gel formed in aqueous organic solvents. In this work, the general printability of these gels was demonstrated. Additionally, it was shown that this acellular biomaterial ink can be printed into a complex structure as well. The second focus of this dissertation dealt with the characterization of newly developed bioinks. Based on the recombinant spider silk proteins, bioinks with cell densities of up to ten million cells per milliliter were generated and their rheological behavior, printability, and cell viability examined. This work showed that both eADF4(C16) and its integrin-binding peptide RGD containing variant eADF4(C16)-RGD are suitable for processing with high cell content and to be extrusion printed. As demonstrated for the acellular biomaterial inks before, these bioinks were able to bridge gaps up to 16 millimeters without any support. Regarding the cellular development during maturation of printed construct, the RGD-containing variant showed an advantage over eADF4(C16). The third focus of this dissertation dealt with the development of new drug depots and delivery release systems. Firstly, the eADF4(C16)-gel formed in an aqueous organic solvent was successfully loaded with the water-insoluble drug 6-mercaptopurine. The subsequent release from the gel was demonstrated as well. In combination with the before achieved printability, new possibilities were enabled for this material. For example, the gels could find applications as injectable drug depots. The fourth focus lay in controlling the release of drugs and substances. Therefore, two covalent systems were established on recombinant spider silk proteins. Using genetic as well as chemical modifications, redox- and ph-sensitive coupling was achieved on different eADF4(C16)-variants. In this work, model substances, as well as the therapeutically relevant drugs 6-mercaptopurine and doxorubicin were reversibly coupled on particles and films made of recombinant spider silk proteins. Both systems showed stability under physiological conditions with the option to controllably release the substance upon applying a specific trigger. These modifications allow for future functionalization of biomaterial- and bioinks, either via a direct coupling or via encapsulation of drug-loaded particles within the material. This will enable to navigate the cellular development during the maturation of biofabricated constructs.