Methyljasmonat induzierte Seneszenz in Chloroplasten aus Primärblättern der Gerste (Hordeum vulgare L.): Analyse der Ultrastruktur und des Proteinimports

Titelangaben

Springer, Armin:
Methyljasmonat induzierte Seneszenz in Chloroplasten aus Primärblättern der Gerste (Hordeum vulgare L.): Analyse der Ultrastruktur und des Proteinimports.
Bayreuth , 2007
( Dissertation, 2007 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Seneszenz eines Blattes umfasst dessen abschließende Phase im pflanzlichen Entwicklungsprozess und stellt somit eine der wichtigsten Schlüsselpositionen im Lebens- und Entwicklungszyklus des Individuums dar. Es sind damit dramatische Veränderungen auf molekularem, biochemischem und strukturellem Niveau untrennbar mit der Seneszenz verbunden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten seneszenzbedingte Veränderungen an Plastiden untersucht werden, wobei der Frage, ob die Plastidenhüllmembran bis in relativ späte Phasen der Seneszenz unverändert bleibt, speziell Rechnung getragen werden. Dazu wurde zunächst ein experimentelles System etabliert, bei dem es möglich war, Seneszenz in Primärblättern der Gerste gezielt zu induzieren und deren Ablauf, im Vergleich zur natürlichen Seneszenz, zu beschleunigen. Von vier getesteten seneszenz-auslösenden Faktoren, zeigte einzig die Behandlung mit Methyljasmonat beide der erwarteten seneszenz-spezifischen Veränderungen (Chlorophyllverlust und Bildung von Gerontoplasten). Das experimentelle System „Methyljasmonat-induzierte Seneszenz“ zeigte in Bezug auf die seneszens-spezifischen Marker (Chlorophyllabbau, strukturelle Veränderungen) eine hohe Übereinstimmung mit der natürlichen Seneszenz. Seneszenzspezifische Veränderungen der Plastidenhülle sollten sich v. a. auch auf den Import von kernkodierten, chloroplastidären Proteinen auswirken und somit am veränderten Gehalt dieser Proteine im Plastiden messbar sein. So war eine Methyljasmonatinkubation abgeschnittener Gerstenprimärblätter in der Lage, innerhalb von nur 24 Stunden eine quantitativ messbare Abnahme der Menge zweier wichtiger Proteine (Rubisco und LHC II) des Plastiden zu bewirken. Für diese beobachtete Abnahme könnten aber sowohl verminderte Synthese-, als auch erhöhte Abbauraten der betroffenen Proteine verantwortlich sein. Aus diesem Grund wurden die Genexpressionsmuster von chloroplastidären Proteinen, insbesondere des Proteinimports, analysiert. Die Analyse der Genexpressionsmuster der chloroplastidären Proteine Rbcs und LHC II ergaben nun, dass unter Methyljasmonateinfluss die jeweiligen korrespondierenden mRNA-Mengen dieser Proteine abnahmen. Es handelte sich aber nicht um einen generellen RNA-Abbau, da die rRNA Mengen gleich blieben. Die Abnahme der Konzentration dieser plastidären Proteine war zumindest zum Teil durch eine Abnahme ihrer Synthese bedingt. Bei einem an Chlorophyllabbau beteiligten Protein, LLS1, wurde demgegenüber bei Methyljasmonatinkubation ein Ansteigen der Proteinmenge im Chloroplasten beobachtet, was zu der Annahme führt, dass es auch während der Methyljasmonat-induzierten Seneszenz einen funktionierenden Proteinimportapparat geben sollte. Zum Vergleich von Proteinimportkapazitäten von Chloroplasten unterschiedlicher Entwicklungsstufen wurden die Isoenzyme der NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase verwendet, wobei gezeigt werden konnte, dass der Import von pPORB durch den Standardproteinimportapparat (TIC-TOC Maschinerie) und der Import von pPORA entwicklungsabhängig - über einen pPORA-spezifischen Importapparat (PTC) in Abhängigkeit vom Substrat Protochlorophyllid (Pchlid) - erfolgte. Untersuchungen des Importverhaltens von pPORB in Chloroplasten ergab, dass sowohl in Plastiden aus frischen Blättern als auch nach Flotation auf Wasser, ein Import erfolgte. pPORA wurde nur in Pchlid-haltige, nicht jedoch Pchlid-freie Chloroplasten der Frischkontrolle importiert (außer bei Flotation auf Wasser). Eine Behandlung von Blättern mit Methyljasmonat wirkte sich immer hemmend auf den Import beider Präkursoren aus. Mit den angeschlossenen Crosslinking-Experimente zeigten sich weder Proteine der TIC-TOC-Maschinerie noch des PTC-Komplexes. Es kann also davon ausgegangen werden, dass es jedenfalls zu Veränderungen des ganzen oder zu Teilen des Standardproteinimportapparates kommen muss. Diese Veränderungen des Standardproteinimportapparates in der äußeren Plastidenhülle wurden mit Hilfe von speziellen elektronenmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei lag das Hauptaugenmerk auf dem integralen Teil des Standardproteinimportapparates, der den zentralen Kanal durch die äußere Hüllmembran bildet (TOC 75) und den eigentlichen Durchtritt kerncodierter Proteine in den Plastiden vermittelt. Eine Kombination der konventionellen Gefrierbruchtechnik mit der SDS-FRL, gelang es, seneszenzbedingte Veränderungen der Hüllmembran zu detektieren. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die Dichte des TOC 75 Proteins, in der äußeren Plastidenhülle unter Methyljasmonateinfluss innerhalb von 24 Stunden dramatisch abnimmt (Verlust der TOC 75 Immunsignaldichte gegenüber dem Ausgangswert um mehr als 85 %). Dieser deutliche Verlust von TOC 75 in der Plastidenhülle nach Methyljasmonatbehandlung deutet darauf hin, dass eine spezifische Regulation des Imports photosynthetisch wichtiger Proteine während der künstlich induzierten Seneszenz auftritt.

Abstract in weiterer Sprache

Leave senescence marks the final stage of plant development and holds one of the most important key positions of the individual plant live and development. Dramatic changes on a molecular biologically, protein chemistrically and ultra structurally level are inseparable linked with senescence. In the framework of this study senescence caused changes on plastids should be investigated. Special interest is given to the question whether the plastid envelope remains unchanged in early stages of senescence. First of all an experimental system, which makes it possible to induce und to accelerate senescence specifically was established. In order to choose such a experimental system – and to compare it with the naturally occurring senescence – the combination of two parameters are reliable: one was the degradation of chlorophyll and the other was changes of the plastid ultra structure especially the increase of size of Plastoglobuli. Out of four tested systems only treatment with methyljasmonate showed both of the necessary senescence specific changes. This system was highly related to the naturally occurring senescence according to the specific markers. Therefore we regarded our system as suitable to investigate senescence specific changes of the plastid envelope. Such senescence specific changes of the plastid envelope should influence the import of nucleus encoded, chloroplastidic proteins. Obviously, incubation of detached barley primary leaves with methyljasmonate was able within 24 hours to cause a quantitative measurable decrease of two important proteins (Rubisco and LHC II) in the plastid. Responsible of this detected degradation could be decreased synthesis- as well as increased degradation-rates. Therefore the gene expression pattern of chloroplastidic proteins were analysed. Result of the analyses of the gene expression pattern of the chloroplastidic proteins Rubisco and LHC II was that under the action of methyljasmonate the corresponding mRNA-amounts of these proteins decreased. Because there are no changes in the rRNA-amounts detectable simultaneously, it is obviously no general degradation process of RNA. The amount of a photosynthetic non relevant protein, LLS1, increases in methyljasmonate treated plastids, leading to the assumption that at least one functionally protein import apparatus may exist. In order to combine the capacity of protein import of plastids at different developmental stages the isoenzymes of NADPH: protochlorophyllid-oxidoreductase was used. It could be shown that pPORB was transported by the standard protein transport apparatus (TIC-TOC-machinery) and pPORA – depending on the developmental stage – by a pPORA specific way. pPORB, was imported in chloroplasts prepared of fresh leaves or of detached, water floated leaves. Treatment of detached leaves with menthyljasmonate inhibits the import of the precursor. pPORA was imported only in Pchlid containing and not in Pchlid free chloroplasts of fresh leaves as expected. Surprisingly, pPORA was imported independently in chloroplasts of detached, water floated leaves, weather they contain Pchlid or not. The following cross linking experiments showed that in deed pPORA was translocated by the TIC-TOC-machinery in the chloroplasts (of detached, water floated leaves). Cross linking pattern of chloroplasts of methyljasmonate treated leaves are completely different and neither proteins of the TIC-TOC-machinery nor of PTC were detectable. Because methyljasmonate treatment always inhibits the import, it is supposed that there are serious changes of the whole standard protein import apparatus or at least of parts of it. These possible changes of the standard protein import apparatus during methyljasmonat incubation were investigated with special electron microscopic methods. There the main emphasis was placed on the integral part of the standard protein import apparatus building the central cannel thru the outer envelope membrane (TOC 75). The combination of the conventional freeze fracture technique, which allows a distinct topographic presentation and topological identification of the inner and outer plastid envelope membranes, with the SDS-FRL, allowing a safe immunological identification of the integral membrane protein TOC 75, allows us to detect senescence specific changes of the envelope membrane. We showed here for the first time very impressive, that the density of the TOC 75 protein decreases dramatically within 24 hours under the action of mehtyljasmonate (loss of TOC 75 immuno signal density of more than 85 % combined with the start value). This strong alternation of the protein content of the plastid envelope during methyljasmonate influence could act as monitor of senescence related changes of the plastid envelope.