Die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus des Gen-3-Proteins filamentöser Phagen für die Infektion von Escherichia coli

Titelangaben

Eckert, Barbara:
Die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus des Gen-3-Proteins filamentöser Phagen für die Infektion von Escherichia coli.
Bayreuth , 2007
( Dissertation, 2007 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus eines Proteins für dessen Funktionsweise in vivo zu untersuchen. Als Modellsystem diente der filamentöse Phage fd, der Gram-negative Bakterien infiziert. Das Gen-3-Protein (G3P) dieses Phagen ist für die initialen Schritte der Infektion essentiell. G3P ist aus drei Domänen aufgebaut, wobei die C-terminale Domäne das Protein in der Phagenhülle verankert. Die beiden N-terminalen Domänen N1 und N2 bilden eine strukturelle Einheit und wechselwirken mit den beiden zellulären Phagenrezeptoren, dem bakteriellen F-Pilus und TolA in der Zellmembran. Die Wechselwirkung der N2-Domäne mit der Pilusspitze führt zur Dissoziation der beiden Domänen und aktiviert so G3P für die anschließende Interaktion der N1-Domäne mit der C-terminalen Domäne von TolA. Die TolA-Bindungsstelle befindet sich auf N1 an der Domänengrenzfläche und ist deshalb im nativen Ruhezustand des Proteins durch N2 blockiert. Im Verlauf der Infektion muss nach der Pilusbindung die geöffnete, aktive Form des G3P so lange erhalten bleiben, bis N1 mit TolA wechselwirken kann. Die Analyse des Faltungsmechanismus des N1N2-Fragments in vitro zeigte, dass die beiden Domänen N1 und N2 sehr schnell falten, ihre Assoziation im letzten Rückfaltungsschritt jedoch außergewöhnlich langsam ist. Die Geschwindigkeit der Domänenassoziation wird durch die trans-nach-cis-Isomerisierung an Pro213 bestimmt, das in der Gelenkregion zwischen den beiden Domänen lokalisiert ist. Die Isomerisierung in den nativen cis-Zustand ist mit einer Zeitkonstante von 6200 s (bei 25 °C) sehr viel langsamer als Prolinisomerisierungen in anderen Proteinen und wird durch die lokale Sequenzumgebung um cis-Pro213 (Gln212-Pro213-Pro214) verursacht. Die Relevanz der langsamen Prolinisomerisierung für die Phageninfektiosität konnte in Kompetitionsexperimenten nachgewiesen werden. In diesen Experimenten konkurrierten jeweils zwei Phagenvarianten, die sich in ihrer Isomerisierungsrate und damit der Assoziationsrate der beiden Domänen unterschieden, um die Infektion einer E. coli-Kultur. Phagen, die eine langsame Prolinisomerisierung und damit eine lange Lebensdauer des aktiven, geöffneten Zustands mit dissoziierten Domänen aufweisen, setzten sich in den Kompetitionsexperimenten durch. Dass es sich bei der Inaktivierung der Phagen tatsächlich um einen prolinkontrollierten Mechanismus handelt, zeigte der Einfluss der Prolylisomerase Cyp18. Nach Dissoziation der Domänen kontrolliert also die langsame trans-nach-cis-Isomerisierung die Lebensdauer des infektiösen Zustands. Die Infektion von F--Zellen mit in vitro aktivierten Phagen ermöglichte es, die Lebensdauer des aktiven Zustands und die Kinetik der Inaktivierung der Phagen zu bestimmen. Die für verschiedene Phagenvarianten erhaltenen Zeitkonstanten spiegelten dabei die Isomerisierungskinetik des entsprechenden G3P-Proteins in vitro wider. Die langsame Prolinisomerisierung in der Gelenkregion steuert so die Funktion des G3P bei der Phageninfektion, indem Pro213 sowohl als Schalter als auch als Zeitgeber wirkt. In der nativen cis-Konformation steht dieser Schalter auf „aus“, die beiden Domänen N1 und N2 sind fest miteinander assoziiert und die Gelenksubdomäne liegt gefaltet vor. Entsprechend sind die Phagen in dieser Ruheform stabil, aber nicht infektiös. Die Bindung der N2-Domäne an den F-Pilus führt zur Dissoziation der beiden Domänen. Mit Hilfe CD-spektroskopischer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Gelenkregion in diesem offenen, aktivierten Zustand entfaltet vorliegt. Dies führt zu einer Destabilisierung der N2-Domäne. Ob N2 bei der Infektion ebenfalls entfaltet vorliegt, konnte jedoch nicht gezeigt werden. Als Folge der partiellen Entfaltung der Gelenkregion isomerisiert Pro213 aus dem sterisch anspruchsvollen cis- in den stabileren trans-Zustand, welcher der „an“-Stellung des Prolinschalters entspricht. Die sehr langsame Rückisomerisierung in die native cis-Konformation fungiert nun als Zeitgeber und gewährleistet, dass G3P lange genug geöffnet und partiell entfaltet bleibt, um eine Wechselwirkung zwischen der N1-Domäne und TolA in der Zellmembran zu ermöglichen. Neben dem Faltungsmechanismus beeinflusst auch die Stabilität des G3P die Infektiosität der Phagen. Mit Hilfe von Infektionsexperimenten von F+- und F--Zellen konnte gezeigt werden, dass die Infektiosität stark von der Stabilität des G3P, insbesondere von der Stärke der Domäneninteraktion, anhängt. Mit zunehmender Stabilität nimmt die Infektiosität ab, und stabilisierende Mutationen erschweren den Übergang in die aktive, partiell entfaltete Form mit dissoziierten Domänen. Die Stabilität des G3P ist daher so angepasst, dass einerseits eine Stabilität der Phagen im Ruhezustand garantiert ist, und es andererseits bei Bindung an den F-Pilus durch Domänendissoziation aktiviert werden kann.

Abstract in weiterer Sprache

The aim of this thesis was to determine the relevance of the stability and the folding mechanism of a protein for its function in vivo. The filamentous bacteriophage fd that infects Gram-negative bacteria served as a model system. The gene-3-protein (G3P) of the phage is essential for the initial steps of infection. G3P consists of three domains. The C-terminal domain anchors the protein in the phage coat, the two N-terminal domains N2 and N1 form a structural entity and interact sequentially with two receptors, the bacterial F pilus and TolA in the cell membrane. Binding of the N2 domain to the tip of the pilus causes dissociation of the two domains and thus activates G3P for the subsequent interaction of domain N1 with the C-terminal domain of TolA. The binding site for TolA on domain N1 is localized at the domain interface, and therefore it is blocked by N2 when G3P is in its native, latent form with N1 and N2 thightly associated. In the course of phage infection, the open, binding-competent form of G3P must persist until N1 interacts with TolA. Analysis of the folding mechanism of the N1N2 fragment in vitro showed that both domains fold rapidly. After these initial conformational refolding steps, the two domains are loosely associated. In a final very slow folding reaction, the two domains then become locked. This locking reaction is controlled by the trans-to-cis isomerization at Pro213 in the hinge between the two domains. The isomerization shows a time constant of 6200 s and is much slower than prolyl isomerizations in other proteins. The unusually low isomerization rate of G3P is determined by the local sequence around cis-Pro213 (Gln212-Pro213-Pro214). The importance of the slow prolyl isomerization for the phage infectivity was examined in competition experiments, in which two phage variants that differ in their isomerization rate und thus in the rate of domain association, compete against each other for the infection of a single E. coli culture. Phage variants with a slow prolyl isomerization and thus a long life time of the open, active state after pilus-induced domain dissociation prevailed in the competitive infections each time. Furthermore, the adverse effect of the prolyl isomerase cyclophilin 18 on phage infectivity confirms that the infection is controlled by a proline-limited mechanism. The trans-to-cis isomerization determines the life time of the open, infectious form of the phage after domain dissociation. Infection of F pilus deficient cells with in vitro activated phage was used to determine the life time of the active state and the kinetics of phage inactivation. For all phage variants investigated, the loss of infectivity in vivo showed the same time course as the proline isomerization of the corresponding protein in vitro. Thus, the slow prolyl isomerization in the hinge region controls the function of G3P during phage infection. Pro213 acts as a switch and as a timer. With Pro213 in the native cis state the timer is switched off, domains N1 and N2 are tightly associated, and the hinge domain is folded. Correspondingly, phage in this latent state are stable, but not infectious. Binding of domain N2 to the F pilus activates G3P by domain dissociation, and CD-spectroscopic analysis revealed that the hinge region is partially unfolded in this open, active state. This loss of domain interactions leads to destabilization of the N2 domain, however, it remains unclear, whether N2 unfolds during infection. As a consequence of the unfolding of the hinge, the isomeric state of Pro213 becomes uncoupled from folding, and Pro213 isomerizes to the more stable trans conformation. The proline switch is now turned on. The very slow re-isomerization into the native cis state subsequently acts as a timer and ensures that G3P remains in the active, partially unfolded state long enough to allow interaction of N1 with TolA in the cell membrane. A fine-tuned stability of G3P is important for the phage infectivity as well. Infection of F pilus bearing cells and F pilus deficient cells indicates that infectivity inversely correlates with the stability of G3P, in particular with the strength of domain interactions, as stabilizing mutations suppress the transition into the active, partially unfolded state with dissociated domains. The stability of G3P must be adjusted such that it guarantees the stability of the phage in its latent state, but also allows phage activation by pilus-induced unfolding of the hinge and domain dissociation.