Lokalisierung und molekulare Charakterisierung eines Pederin produzierenden Endosymbionten der Gattung Pseudomonas aus dem Kurzflügler Paederus riparius(Coleoptera: Staphylinidae)

Titelangaben

Matthias, Kador:
Lokalisierung und molekulare Charakterisierung eines Pederin produzierenden Endosymbionten der Gattung Pseudomonas aus dem Kurzflügler Paederus riparius(Coleoptera: Staphylinidae).
Bayreuth , 2007
( Dissertation, 2007 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Weibliche Kurzflügelkäfer der Gattung Paederus beherbergen einen mit Pseudomonas aeruginosa sehr nahe verwandten Endosymbionten, der für die Synthese des stark cytotoxischen Naturstoffs Pederin verantwortlich ist. Die ökologische Bedeutung dieses Giftstoffs für die Käfer liegt dabei offenbar in einer Abwehrfunktion gegenüber potentiellen Prädatoren, wie z. B. Wolfsspinnen, begründet. Aufgrund einer sehr hohen tumorhemmenden und antiviralen Wirksamkeit ist Pederin in erster Linie für die medizinische Forschung interessant. Ziel dieser Arbeit war es, den Endosymbionten von Paederus riparius mit verschiedenen mikrobiologischen und molekularen Methoden in den Käfern bzw. auf deren Eiern exakt zu lokalisieren, um somit die Organisation dieser Bakterien im Wirtsinneren näher zu beleuchten und deren Übertragungsweg auf die Nachkommenschaft aufklären zu können. Durch eine gezielte Isolierung des Pederin-Symbionten sollte dieser schließlich auf exakt abgestimmten, Agar basierten Kulturmedien angezüchtet werden, um letztlich eine Produktion dieses komplizierten Polyketids außerhalb der Käfer in ökologisch nachhaltiger Weise gewährleisten zu können. 1. Mit Hilfe von Pederin-Gen-spezifischen Primern konnte der Endosymbiont in den Abdominalspitzen der Käfer detektiert werden. Eine sich anschließende molekulare Untersuchung verschiedener abdominaler Organe zeigte, dass das Vorhandensein des symbiontischen Bakteriums ausschließlich auf die am weiblichen Geschlechtsapparat paarig angelegten Anhangsdrüsen und den Ausführgang begrenzt ist. Über eine in situ-Färbung dieser Drüsen mit dem Nucleinsäurefarbstoff DAPI konnte daraufhin zum ersten Mal das Vorhandensein einer morphologisch einheitlichen, stark an Pseudomonas erinnernden Kolonie gezeigt werden. 2. Der Einsatz einer fluoreszenzmarkierten Gensonde ermöglichte es, das endosymbiontische Bakterium in Serien-Dünnschnitten von Abdomina und Eiern gezielt sichtbar zu machen. Dabei zeigte sich im Falle der Abdominalschnitte, dass der Pederin-Produzent in einer enorm hohen Dichte als Reinkultur in den Anhangsdrüsen und in etwas geringerer Menge in bestimmten Bereichen des Ausführgangs lokalisiert ist, in den die beiden Symbionten-Drüsen münden. Im Falle der Ei-Dünnschnitte konnte der Endosymbiont auf einer die Eischale umgebenden warzenartigen Schicht detektiert werden, auf die das Bakterium in einer biofilmartigen, festen Matrix aufgebracht ist. Die Verteilung der Symbionten-Zellen erstreckte sich dabei stets über die gesamte Ei-Oberfläche. Ein möglicher Weg der Übertragung vom Weibchen auf die Eier wäre die aktive oder passive Abgabe einer definierten Menge Bakterienmaterial über einen Schleusenmechanismus, der die Anhangsdrüsen gegenüber dem Inneren des Ausführgangs während der Ei-Passage öffnen und verschließen kann. 3. Mit einer speziellen Sektionstechnik gelang es, den Endosymbionten von seinem Insekten-Wirt zu isolieren. Die lichtmikroskopische Untersuchung der Bakterienlösung zeigte dabei das Vorhandensein einer Pseudomonas aeruginosa sehr ähnlichen, offenbar kontaminationsfreien Zellkolonie. Den endgültigen Beweis, dass es sich dabei um eine Reinkultur des Paederus-Endosymbionten handelte, erbrachte jedoch erst die fluoreszenzmikroskopische Auswertung der mit der spezifischen Gensonde hybridisierten Zellen. 4. Anhand der isolierten Reinkultur des Pederin produzierenden Symbionten konnte über verschiedene Enzymtests gezeigt werden, dass es sich um ein gramnegatives Bakterium mit einem aeroben oder mikroaerophilen Stoffwechsel handelt, das jedoch im Gegensatz zu den Pseudomonaden vollständig unbegeißelt ist. Die dafür benötigten Gene sind offenbar im Zuge der endosymbiontischen Anpassung an den Käfer-Wirt durch zahlreiche Genomreduktionen verloren gegangen. Dies gilt wahrscheinlich ebenso für die Gene, die Pseudomonas aeruginosa die Fähigkeit zur Denitrifikation verleihen. Diese Gene konnten im Rahmen spezifischer PCR-Experimente in den Endosymbionten nicht nachgewiesen werden. Darüber hinaus erbrachte eine vergleichende RFLP-Analyse der endosymbiontischen 16S rDNAs der beiden voneinander kontinental getrennten Paederus-Arten P. riparius und P. sabeus die Erkenntnis, dass eine genetische Aufspaltung des Pederin-Symbionten in eigenständige Arten noch nicht stattgefunden hat. 5. Ein mögliches Wachstum des Endosymbionten konnte mit den Pederin-Gen-spezifischen Primern in einem flüssigen Anreicherungsmedium nachgewiesen werden. Durch eine Beimpfung der verschiedensten universellen und selektiven Nährböden mit Ei- bzw. Käfer-Homogenisat konnte im Laufe der Kultivierungsexperimente eine Vielzahl grampositiver und gramnegativer Bakterien kultiviert werden. Eine gezielte Anzucht des Paederus-Endosymbionten auf diesen Medien konnte jedoch nicht erreicht werden, was nicht zuletzt auch auf einen zu geringen Kenntnisstand über die möglicherweise sehr speziellen Nährstoffanforderungen der Pederin-Produzenten außerhalb ihrer Käfer-Wirte zurückgeführt werden kann.

Abstract in weiterer Sprache

Female rove beetles of the genus Paederus s. l. (Coleoptera: Staphylinidae) harbour endosymbiotic bacteria, which are closely related to Pseudomonas aeruginosa. These microorganisms are responsible for the biosynthesis of the natural product pederin, which exhibits strong cytotoxic properties. The ecological importance of this poisonous substance for the beetles apparently lies well-founded in deterring potential predators like wolf spiders. Due to its highly active antitumoral and antiviral efficiency the polyketide pederin is predominantly interesting for medical researches. The aim of this dissertation was to exactly localize the endosymbiont of Paederus riparius by using microbial and molecular techniques inside the beetles and on their eggs respectively, for highlighting the organisation of these bacteria inside their hosts and elucidating their mode of transmission to the beetles’ offspring. Finally, the pederin-symbiont should be cultivated on accurately balanced, agar based culture media by well-directed isolation from its host, in order to assure an ecologically sustainable production of this complex polyketide outside the beetles. 1. Via pederin-specific primers, the endosymbiont could be detected in the female beetles’ abdominal tips. Subsequent molecular analysis of different abdominal organs revealed the existence of the symbiotic bacterium being restricted exclusively to the pairwise attached accessory glands of the females’ internal genitalia and the efferent duct. In situ staining of the accessory glands with the nucleic acid-dye DAPI showed for the first time the existence of a morphologically uniform bacterial colony with strong similarity to Pseudomonas. 2. Application of a specially constructed, fluorescently labeled gene-probe enabled a directed visualisation of the symbiotic bacterium in serial thin sections of abdomina and eggs. In the case of abdominal-sections it could be demonstrated that the pederin-producer is localized in tremendous density as pure culture in the accessory glands and in somewhat lower amount in certain areas of the efferent duct, into which both symbiont glands lead. Looking at the egg thin sections, the endosymbiont could be detected on a tuberculate layer that coats the chorion and to which the bacterium is applied to in a biofilm-like solid matrix. Thereby the allocation of symbiont-cells always extended over the whole egg surface in a thin layer. A possible mode of transmitting the endosymbionts from the females onto their eggs could be an active or passive release of a well-defined amount of bacterial substance through a sluice-mechanism, which can open and close the accessory glands to the interior of the efferent duct during egg-passage. 3. Using a specific dissection-procedure, it could be managed to isolate the endosymbiont from its insect host. Microscopical examination of the obtained bacterial solution revealed the existence of a Pseudomonas aeruginosa like cell colony, which apparently was free of contaminating microorganisms. The final proof, that is was about a pure culture of the Paederus-endosymbiont, could be adduced by fluorescent-microscopical analysis of cells being hybridized with the specific gene-probe. 4. It could be demonstrated via enzymatic tests of the isolated pure culture of the pederin-producing symbiont, that it is about a gram-negative bacterium with aerobic or microaerophilic metabolism, being completely unflagellated compared to the pseudomonads. The therefore required genes apparently got lost by numerous genome reductions in the course of endosymbiotic accommodation to the beetle-host. This probably also counts for the genes, which give Pseudomonas aeruginosa the capability of denitrification. However, these genes could not be detected in the endosymbionts within the scope of specific PCR-experiments. Furthermore, a comparative RFLP-analysis of the endosymbiotic 16S rDNAs of both continentally separated Paederus-species, P. riparius and P. sabeus, adduced that a genetic divergence of the endosymbiont in independent species did not occur yet. 5. A possible endosymbiotic growth in a liquid enrichment medium could be proved with pederin-gene-specific primers. By inoculation of many different universal and selective nutrient media with homogenate from eggs and beetles, respectively, a multitude of gram-positive and gram-negative bacteria could be cultivated over the breeding-experiments. However, a well-directed starting of the Paederus-endosymbiont on these media could not be achieved, not least because of too little knowledge about possibly very specific nutrient requirements, the pederin-producers need outside their beetle-hosts.