Molekularbiologische Gewinnung von RNase 40-124 Fragmenten zur Synthese von einheitlichen Glycoproteinen durch native chemische Ligation

Titelangaben

Piontek, Christian:
Molekularbiologische Gewinnung von RNase 40-124 Fragmenten zur Synthese von einheitlichen Glycoproteinen durch native chemische Ligation.
Bayreuth , 2007
( Dissertation, 2008 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Bereitstellung von einheitlichen Glycoproteinen ist wegen der Mikroheterogenität und der Probleme bei der Isolierung aus natürlichen Quellen eine ungelöste Aufgabe. Nur mit homogenem Material sind detaillierte Untersuchungen der Struktur-Wirkungsbeziehung möglich, was zur Optimierung von therapeutischen Glycoproteinen verwendet werden kann. Deshalb sollten Methoden zur Totalsynthese von uniformen Glycoproteinen etabliert werden. Dazu sollte die chemoselektive Reaktion von Thioestern und molekularbiologisch gewonnenen Fragmenten mit N-terminalem Cys über die native chemische Ligation (NCL) ausgenutzt werden. Diese Methode sollte mit dem Modellprotein Ribonuclease 1-124 entwickelt werden. Zur Synthese der RNase durch NCL wurde das Cys 40 als Ligationsstelle gewählt. Das Fragment 40-124 B mit N-terminalem Cys sollte mit dem Thioester Met-RNase 1-39 A bzw. glycosylierten Varianten über sequentielle Ligationsschritte zur RNase ligiert werden. Zur Gewinnung des N-terminalen Cys-fragmentes 40-124 B der RNase wurde das pTWIN-Expressionssystem verwendet, das die autokatalytische Spaltung von Inteinen ausnutzt. Durch Expression des Plasmids pTWINcp1 in E. coli konnte das Fusionsprotein als unlösliche IBs erhalten werden. Diese wurden gereinigt, solubilisiert und unter optimierten Bedingungen rückgefaltet. Trotz einer fast vollständigen Inteinspaltung konnte das oxidationsempfindliche und möglicherweise unlösliche Zielpeptid RNase 40-124 B nicht isoliert werden. Deshalb wurden die sieben Cys von B vor der Rückfaltung und Inteinspaltung durch gemischte Disulfide geschützt. Die Reaktion mit GSSG oder DTDP ergab eine Mischung von Peptiden 1, 3, 5 und 7 modifizierten Cys. Die vollständige Reaktion aller Cys gelang mit 2-Carboxyethyl-methanthiosulfonat, jedoch bei geringerer Spaltungseffizienz des Inteins. Nach Reinigung mittels RP-HPLC konnte das 7-fach geschützte und nicht mehr oxidationsempfindliche Fragment 3 in einer Ausbeute von 3.5 mg pro Liter Medium erhalten werden. Die Ligationsfähigkeit der modifizierten Fragmente 1 und 2 wurde mit den Thioester Met-RNase 1-39 4 und dem Glyco-Thioester RNase 30-39 8 untersucht und die Reaktion zu 5 und 9 durch LC-MS bestätigt. Mit Hilfe des vollständig modifizierten Fragmentes RNase 40-124 3 konnte unter optimierten Ligationsbedingungen die vollständige Met-RNase 1-124 5 erhalten werden und nach einem Rückfaltungsschritt die enzymatische Aktivität durch Hydrolyse von 2’,3’-CMP nachgewiesen werden. Die Synthese von glycosylierter RNase 1-124 sollte durch eine sequentielle Ligationsstrategie versucht werden. Dazu wurde das Fragment 1-39 in den Thioester 1-25 F und den glycosylierten Thioester 26-39 D geteilt, dessen N-terminales Cys durch verschiedene Schutzgruppen maskiert wurde. Die Ligation zwischen dem vollständig SCE-geschützten Fragment RNase 40-124 3 und den Thioestern Thz-26-39 15 bzw. Mapoc-26-39 20 konnte durchgeführt werden. Die Ligation zu 16 bzw. 21 und die Abspaltung der Schutzgruppen unter Freisetzung des N-terminalen Cys konnte mittels LC-MS nachgewiesen werden. Zwar konnte nach der Öffnung des Thiazolidinringes mit Methoxyamin eine Ligation mit dem Thioester RNase 1-25 18 zur vollständigen RNase 1-124 19 nachgewiesen werden, allerdings reagierte der größte Teil des Thioesters mit Methoxyamin zum Methoxyamid. Deshalb wurde anstelle der sequentiellen Eintopf-Ligationsstrategie ein Syntheseweg mit Isolierung des Ligationsproduktes 26-124 nach der Methoxyaminentschützung angewandt. Diese Methode konnte mit den Ligationsprodukten RNase Thz-26-124 24 und 28 etabliert werden. Die entschützten Produkte wurden mit einer Ausbeute von 44 % bzw. 74 % isoliert und mit dem Thioester 18 zu den RNasen 26 und 30 ligiert. Nach einer Rückfaltung der synthetischen Proteine konnte mit einem Assay deren Aktivität nachgewiesen werden. Diese Erkenntnisse konnten zur Synthese der kompletten RNase 1-124 34 mit einem Nonasaccharid an Asn34 angewandt werden. Die Isolierung des entschützten Ligationsproduktes 33 aus der Reaktion von RNase 40-124 3 mit dem Glycopeptidthioester RNase Thz-26-39 31 gelang mit einer Ausbeute von 48 %. Das Produkt wurde mit 18 zur Reaktion gebracht und zurückgefaltet. Nach Reinigung mittels Gelfiltration konnte das native Enzym 34a in einer Ausbeute von 71 % gewonnen werden. Die RNase-Aktivität des synthetischen Glycoproteins 34a wurde durch Vergleich mit der Aktivität von RNase A mit einem kcat/Km-Wert von 9.6 x 102 M-1 s-1 bestimmt (RNase A = 5.6 x 103, RNase B = 1.5 x 103 M-1 s-1). In dieser Arbeit konnte eine reproduzierbare Methode zur molekularbiologischen Gewinnung von Fragmenten mit N-terminalem Cys etabliert werden. Mit Hilfe eines rekombinanten RNase-Fragmentes und den entprechenden Thioestern bzw. Glycopeptidthioestern konnte erstmals ein biologisch aktives, homogenes RNase-Glycoprotein mit komplexem N-Glycan erhalten werden. Diese Strategie sollte auf die Synthese von biochemisch und therapeutisch interessanten Proteinen übertragbar sein.

Abstract in weiterer Sprache

The production of sufficient amounts of homogeneous glycoproteins still remains a very difficult task. The microheterogenity leads to a number of problems when trying to isolate single glycoforms from natural sources. Detailed structure activity relationships are only possible with uniform material, e.g. for optimizing the properties of therapeutic glycoproteins. Therefore methods aiming at the total synthesis of homogeneous glycoproteins should be investigated in this work. The chemoselective native chemical ligation was chosen to connect glycopeptide thioesters with fragments bearing an N-terminal cysteine. This strategy was optimized using bovine ribonuclease 1-124 as a model system. The cysteine at position 40 was selected as the ligation site for the different forms of RNase. With the fragment 40-124 B in hand, ligations with thioester Met-RNase 1-39 or other glycosylated thioesters were investigated. In order to obtain the N-terminal cysteine fragment RNase 40-124 B the pTWIN1 expression system was used, which contains self cleaving inteins. After overexpression of the plasmid pTWIN1cp1 the fusion protein was obtained as insoluble inclusion bodies. These were purified, dissolved and refolded using an optimized refolding buffer. Although a nearly complete intein cleavage was achieved, it was not possible to isolate the target peptide RNase 40-124 B due to its potential insolubility and sensitivity to oxidation. Therefore the 7 cysteines of the peptide were modified as mixed disulfides prior to refolding and intein cleavage. The reaction with GSSG or 3,3’-dithio dipropionic acid gave a mixture of target peptides containing 1, 3, 5 and 7 mixed disulfides. Complete protection of the seven cysteines could be achieved using 2-carboxyethyl methane thiosulfonate, however, the cleavage efficency of the intein was reduced. After purification by RP-HPLC the fully protected fragment RNase 40-124 3 was obtained yielding up to 3.5 mg per liter of LB- medium. Subsequently it was shown, that the disulfide modified fragments 1 and 2 were suitable for native chemical ligation with thioester Met-RNase 1-39 4 and glycosylated thioester RNase 30-39 8. The formation of the ligation products 5 and 9 was confirmed by LC-MS analysis. With the fully protected peptide RNase 40-124 3 it was possible to synthesize the complete Met-RNase 1-124 5 under optimized ligation conditions. After refolding the RNase activity of the synthetic protein was determined by measuring the hydrolysis of cyclic 2’,3’-CMP. The synthesis of glycosylated RNase 1-124 was attempted by using a sequential ligation strategy. The RNase fragment 1-39 was divided into thioester 1-25 F and the glycosylated thioester 26-39 D, where the N-terminal cysteine was selectively protected. The ligation of RNase 40-124 3 with the thioesters Thz-26-39 15 and Mapoc-26-39 20 gave the glycopeptides 16 and 21. After deprotection of 16 with methoxyamine the second ligation was conducted by addition of thioester RNase 1-25 18 yielding the full length RNase 1-124 19 with a nonasaccharide at Asn34. This ligation did not proceed to completion since the majority of the thioester 18 was converted to a methoxyamide. In order to circumvent this problem, the sequential one pot strategy was modified by isolating of the deprotected ligation product. This method was demonstrated starting with the thioesters 23 and 27 giving the ligation products RNase Thz-26-124 24 and 28. The deprotected glycopeptides were isolated in yields of 44 % and 74 %. These products were allowed to react with thioester 18 to the full lenght proteins 26 and 30. After refolding of the synthetic peptides the RNase activity was confirmed by an enzymatic assay. These improvements set the stage for the synthesis of complete RNase 1-124 34 with a nonasaccharide at Asn34. The ligation product of RNase 40-124 3 and glycopeptide thioester RNase 26-124 31 was isolated after deprotection with methoxyamine in 48 % yield (33). After elongation of the isolated product with thioester 18 refolding was initiated by adding refolding buffer directly into the ligation solution. Purification by size exclusion chromatography gave the native enzyme 34a in a yield of 71 %. The RNase activity was assayed and a kcat/Km-value of 9.6 x 102 M-1 s-1 was found (RNase A = 5.6 x 103 M-1 s-1, RNase B = 1.5 x 103 M-1 s-1). In the course of this work a method for the production of protein fragments bearing an N-terminal cysteine was established via recombinant expression. With a recombinant RNase fragment and the corresponding thioesters and glycopeptidthioesters the first synthesis of a homogeneous, biologically active RNase glycoprotein with a complex N-glycan was achieved. This approach should be valuable for the synthesis of additional glycoproteins of biochemical and therapeutical importance.