Mikrobiologie der Stickstoffentfernung in den Biofiltern einer marinen Aquakultur mit geschlossenem Wasserkreislauf

Titelangaben

Fösel, Bärbel U.:
Mikrobiologie der Stickstoffentfernung in den Biofiltern einer marinen Aquakultur mit geschlossenem Wasserkreislauf.
Bayreuth , 2007
( Dissertation, 2008 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die drohende Erschöpfung mariner Fischbestände bedingte die Entwicklung mariner Aquakulturtechniken und machte die marine Aquakultur zu einem der am schnellsten wachsenden Industriezweige der Welt. Derzeit werden marine Fischarten meist in schwimmenden Netzeinfriedungen oder Käfigen in Küstennähe gezüchtet, was mit einer erheblichen Beeinträchtigung der marinen Umgebung einher geht. Eine umweltfreundliche Alternative zu diesen offenen Systemen sind geschlossene Systeme mit vollständiger Wasserwiederaufbereitung. Die Pilot-Anlage in Rehovot, Israel ist ein derartiges System, das über drei verschiedene Biofilter Nitrifikation, Denitrifikation/Abbau von abgesetztem Schlamm und Sulfidoxidation miteinander verbindet. Die Nitrifikation in einem derartigen System muss einerseits effizient genug ablaufen, um die Ammoniakkonzentrationen unterhalb der für Fische toxischen Werte zu halten. Andererseits muss sie dynamisch genug sein, um auch Fluktuationen in der Ammoniumproduktion puffern zu können. Der erste Teil dieser Arbeit zielte deshalb darauf ab, die Nitrifikantenpopulation in dem marinen Tropfkörperbiofilm zu identifizieren und zu charakterisieren sowie Diversität, Verteilung, Abundanz und Aktivität der Ammonium- und Nitritoxidierer in situ zu bestimmen. Wiederholte Runden des sogenannten „full cycle rRNA-approach“ waren erforderlich, um DNA-Extraktionsprotokoll und Sondenset für die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zu optimieren. Die abundanteste Gruppe der ammoniumoxidierenden Bakterien (AOB) waren Mitglieder der Nitrosomonas sp. Nm143-„Lineage“ (6,7% des Gesamtbiovolumens), gefolgt von einer Nitrosomonas marina-verwandten AOB-Gruppe (2,2% des Gesamtbiovolumens). Beide zusammen wurden zahlenmäßig übertroffen von den nitritoxidierenden Bakterien (NOB) der Nitrospira marina-„Lineage“ (15,7% des Gesamtbiovolumens). Die mittels Mikrosensormessungen bestimmten Nitrifikationsraten stiegen bis zu einer Ammoniumkonzentration von 200 µM nahezu linear an und erhöhten sich weiter bis zu einer Konzentration von 2 mM. Der geschätzte KM(NH3+NH4+)-Wert lag bei 294 (&#61617; 70) µM, die maximale Geschwindigkeit (vmax) der Ammoniumoxidation bei 65 (&#61617; 6) µM cm-3 h-1. Mikroautoradiographie (MAR) mit 14C-markiertem Bicarbonat wurde mit FISH kombiniert, um herauszufinden, welche AOB-Populationen in Gegenwart verschiedener Substratkonzentrationen aktiv sind. Weder Mikrosensordaten noch MAR-FISH-Experimente sprachen jedoch für die postulierte Nischendifferenzierung in eine bezüglich der Ammoniumkonzentration hoch affine und eine weniger affine AOB-Population. Es bleibt weiter unklar, welche Faktoren für die beobachtete Koexistenz verschiedener AOB-Populationen verantwortlich sind. Zusammengenommen scheint die Nitrifikantengemeinschaft jedoch sowohl an die normalerweise geringen Ammoniumkonzentrationen als auch an die wiederkehrenden Peaks nach dem Füttern gut angepasst zu sein. Da Stickstoff, vor allem in Form von Nitrat, in geschlossenen Aquakultursystemen häufig akkumuliert, wird versucht, zumindest einen Teil des Nitrat-N - klassischerweise über Denitrifikation - wieder aus dem System zu entfernen. Ein Problem, das bei der anaeroben Abwasserbehandlung speziell in marinen Systemen auftritt, ist die Sulfatreduktion. Neben seiner toxischen Wirkung auf Fische und andere aquatische Organismen hat Sulfid auch einen spezifischen Effekt auf Nitratreduktion und Denitrifikation. Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es deshalb, die Prozesse der Denitrifikation und der DNRA in den anaeroben Teilen der Anlage zu quantifizieren, Nitratreduzierer und Denitrifikanten zu identifizieren und zu isolieren sowie ihre Reaktion auf Sulfid als einem systemrelevanten Faktor genauer zu untersuchen. Sowohl Denitrifikation als auch DNRA waren - wie durch 15N-Experimente bestätigt - systemrelevante Prozesse. Anzeichen für eine N-Entfernung über den Anammox-Prozess wurden hingegen nicht gefunden. Von insgesamt ca. 780 Isolaten verbrauchten knapp 500 Nitrat. Es wurden 41 verschiedene, teilweise neuen Artengruppen identifiziert, die den Alpha-, Beta- und Gammaproteobacteria, den Bacteroidetes, Firmicutes und Actinobacteria angehörten. 15 enthielten Denitrifikanten, bei Mitgliedern der restlichen Gruppen wurde nur Nitratreduktion zu Nitrit festgestellt. Die kultivierungsunabhängige Analyse anhand der funktionellen Markergene narG und nosZ erbrachte eine beträchtliche Anzahl unterschiedlicher Klongruppen. Im Unterschied zum Kultivierungsansatz ergab die vergleichende Analyse der narG-Genbibliotheken sehr klare Unterschiede zwischen den drei untersuchten Teilsystemen. Wachstumsexperimente mit zuvor aus der Aquakultur isolierten Reinkulturen erbrachten große Unterschiede in der Sulfidtoleranz der getesteten Isolate, die von < 50 µM bis zu 5 mM reichte. Generell gingen steigende Sulfidkonzentrationen mit einer zunehmenden Hemmung des Wachstums und - bei denitrifizierenden Isolaten - mit einer steigenden N2O-Produktion einher.

Abstract in weiterer Sprache

Declining marine fish stocks have fostered a rapid development of marine aquaculture techniques and have made marine aquaculture one of the fastest growing industries in the world. Most marine finfish are reared in floating net pens or cages nearshore. However, this practice often has deleterious effects on the surrounding environment. As an environmentally friendly alternative, a zero-discharge mariculture system was developed that contained a 3-stage biofilter for nitrification, denitrification/anaerobic sludge digestion, and sulfide oxidation. Nitrification in such a system has to be efficient enough to keep ammonia concentrations below toxic levels, yet dynamic enough to buffer fluctuations in ammonium production. Thus, the aim of the first part of this work, was to identify and characterize the nitrifyer community in the marine trickling filter biofilm and to determine diversity, distribution, abundance, and activity of the ammonia- and nitrite-oxidizers in situ. Repeated rounds of the full-cycle rRNA approach were necessary to optimize DNA extraction and probe set for fluorescence in situ hybridization (FISH). The most abundant ammonia-oxidizing bacteria (AOB) were members of the Nitrosomonas sp. Nm143-lineage (6.7% of the total biovolume), followed by Nitrosomonas marina-like AOB (2.2% of the total biovolume). Both were out-numbered by nitrite-oxidizing bacteria (NOB) of the Nitrospira marina-lineage (15.7% of the total biovolume). Nitrification rates as determined by microsensor measurements increased linearly in response to ammonium concentrations up to 200 µM, and further up to 2 mM. The estimated KM(NH3+NH4+) value was 294 (± 70) µM, the estimated vmax was 65 (&#61617; 6) µmol ammonia oxidized cm-3 h-1. Microautoradiography (MAR) using [14C]-bicarbonate was combined with FISH to track active AOB under different substrate concentrations. However, neither microsensor data nor results from the MAR-FISH experiments supported the postulated niche differentiation in one “high affinity” and one “low affinity” population. It remains unclear which factors are responsible for the observed coexistence of different AOB-populations. Nonetheless, the combined data suggest that the nitrifying community is, with its relatively high substrate affinity and dynamic response, well adapted to both the prevailing low substrate concentrations and the recurrent ammonium peaks. Denitrification is used to control nitrate concentrations, which would otherwise accumulate in a closed system. A problem, especially in marine systems where the water sulfate content is high, is the occurrence of sulfate reduction under anaerobic conditions. Besides its toxicity on fish and other aquatic organisms, sulfide may also affect nitrate reduction and denitrification. Thus, the goal of the second part of this study, was to quantify denitrification and DNRA in the anaerobic treatment loop, to identify and isolate nitrate-reducing and denitrifying bacteria from the different biofilters, and to investigate their response to sulfide concentrations relevant for the system. Denitrification and DNRA as determined by 15N-tracer experiments both played a role in nitrate reduction, whereas no signs were found for N-removal via the anammox process. From a total of about 780 isolates, almost 500 consumed nitrate. In total, 41 different groups of nitrate-reducing/denitrifying isolates were identified. Some groups contained novel species, mostly affiliating with Alphaproteobacteria but also Beta- and Gammaproteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, and Actinobacteria. 15 groups contained denitrifiers, while members of the remaining 26 only reduced nitrate to nitrite. Culture-independent analysis based on the functional marker genes narG and nosZ yielded considerable numbers of different clone groups. The narG-based analysis revealed significant differences between the nitrate-reducing and denitrifying populations of the three system parts, whereas differences found via the cultivation approach were much less pronounced. Growth experiments with pure cultures previously isolated from the system revealed large differences in sulfide-tolerance among isolates, ranging from < 50 µM to 5 mM sulfide. Increasing sulfide concentrations generally resulted in increased nitrous oxide production. Furthermore, evidence for the presence of sulfide-oxidizing nitrate reducers and/or denitrifiers was obtained. Anoxic batch incubations of sludge with 15N-nitrate and varying sulfide concentrations confirmed the in situ relevance of these observations and indicated that sulfide induced a shift from denitrification to DNRA.